焦磷酸测序和MassARRAY定量检测DNA甲基化在年龄推断中的差异
发布时间：2021-09-17 04:21
目的利用MassARRAY和焦磷酸测序两种方法检测的DNA甲基化数据在年龄推断中的差异,探讨两种检测方法的年龄推断计算方法。方法应用MassARRAY和焦磷酸测序,分别对65份和62份外周血样本的9个CpG位点的甲基化水平进行测定,运用多元线性回归模型预测年龄,对比预测年龄与实际年龄之间的差异;对比Z-score转化前后两种方法之间的年龄预测差异。结果 MassARRAY法,65样本集数据Z-score转化前,平均绝对误差（MAD）=2.49岁,Z-score转化后,MAD=2.44岁;62样本集数据Z-score转化前,MAD=3.36岁,Z-score转化后,MAD=3.42岁。焦磷酸测序法,65样本集数据Z-score转化前,MAD=4.20岁,Z-score转化后,MAD=2.76岁;62样本集数据Z-score转化前,MAD=3.92岁,Z-score转化后,MAD=3.63岁。结论 Zscore转化方法能够有效的消除MassARRAY和焦磷酸测序数据之间的系统性批次效应;MassARRAY数据可以直接使用进行样本的年龄预测;使用焦磷酸测序数据进行年龄预测结果误差较大,但可以...
【文章来源】：南方医科大学学报. 2020,40(12)北大核心CSCD
【文章页数】：7 页
【部分图文】：
MassARRAY和焦磷酸测序的CpG位点的甲基化水平比较
本项研究进一步证明不同的甲基化检测方法存在系统性差异，而且这种差异可以通过Z-score转换算法得到有效降低。通过Z-score转换技术可以有效的将利用焦磷酸测序DNA甲基化数据进行年龄预测的误差降低到同MassARRAY相似的水平。但是，由于目前的年龄预测模型是基于MassARRAY数据构建的，因此对于MassARRAY检测的数据，可以直接通过我们已发表的年龄预测网站进行年龄推断（http://liufan.big.ac.cn/AgePrediction/）[23-24]，进而应用于刑事科学技术年龄推断；焦磷酸测序数据则必须首先将检测数据进行Z-score转化才能得到相对准确的预测结果，而单个样本无法进行Z-score转化以及样本太少会造成较大的Z-score转化误差，因此在利用Z-score转化模型时需要时间积累焦磷酸平台样本数据，但这对于实际的案件应用所面临的迫切性是矛盾的。针对这个问题，我们建议目前统一使用MassARRAY进行DNA甲基化水平检测。另外，随着时间的积累，当积累了足够多的焦磷酸测序数据后，重新训练一个针对焦磷酸测序检测方法的年龄预测模型不失为一个更好的解决方案，并对比两种方法的年龄预测成效，从而使甲基化推断年龄在刑事技术方面发挥更大的作用。
甲基化的定量检测分为3步：亚硫酸氢盐转化、PCR扩增、甲基化测定。MassARRAY和焦磷酸测序在技术原理方面存在差异，其差异重点是第三步甲基化测定。首先检测前对基因组DNA进行亚硫酸氢盐转化[26],DNA中未甲基化的胞嘧啶（C）转变为尿嘧啶（U），而甲基化的胞嘧啶（C）保持不变，因此将甲基化的差异变为序列的差异。亚硫酸氢盐转换后进行PCR扩增，将序列差异性成比例的放大后用于下一步的甲基化定量检测。在甲基化测定中，MassARRAY和焦磷酸测序技术均需要4～5个小时完成定量检测，而且都被用于法庭科学年龄推断研究[16,27]，但是两种方法检测原理不同。MassARRAY结合了碱基特异性酶切反应和MALDI-TOF检测原理，可实现多个CpG的分析检测，碱基特异性酶切实验由亚硫酸氢盐处理待测DNA开始，经过亚硫酸氢盐处理，由此在DNA模板中产生甲基化特异的序列变化；利用5"末端带有T7-启动子的引物进行PCR扩增，产物经SAP处理后用于碱基特异性的酶切反应；酶切后DNA片段的大小和分子量取决于亚硫酸氢盐处理后的碱基变化，飞行质谱能测出每个片段的分子量，配套软件MassARRAY EpiTYPER则能自动报告每个相应片段的甲基化程度[27-28]。焦磷酸测序是一种新的DNA序列分析技术，是在同一反应体系中由4中酶催化的酶级联化学发光反应。特异性引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4种酶的协同作用下，将每一个d NTP的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来，荧光信号的强度与结合的核苷酸数目成比例，然后通过荧光检测装置检测荧光的释放和强度，并通过软件将光信号转换为峰图。反应底物为5-磷酰硫酸和荧光素，反应体系包括待测序DNA单链和测序引物。每一轮测序反应中，加入1种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶可将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸集团；硫酸化酶催化APS和PPi形成ATP，后者驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素转化，发出与ATP量成正比的可见光信号，并由Pyrogram转化为一个峰值，其高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比；根据加入dNTP类型和荧光信号强度就可实时记录模板DNA的核苷酸序列[29-30]。在本研究中，选取了两个批次且相互独立的样本，分别使用MassARRAY和焦磷酸测序对9个甲基化位点进行检测，并进行了个体年龄推断分析。结果显示，进行Z-score转换前后，MassARRAY测得的MAD值差异不明显；焦磷酸测序数据由MAD=4.20年降低为MAD=2.76年，可以更加准确的预测年龄，因此，Z-score转换能够有效降低MassARRAY和焦磷酸测序数据之间的系统性批次效应。本项研究进一步证明不同的甲基化检测方法存在系统性差异，而且这种差异可以通过Z-score转换算法得到有效降低。通过Z-score转换技术可以有效的将利用焦磷酸测序DNA甲基化数据进行年龄预测的误差降低到同MassARRAY相似的水平。但是，由于目前的年龄预测模型是基于MassARRAY数据构建的，因此对于MassARRAY检测的数据，可以直接通过我们已发表的年龄预测网站进行年龄推断（http://liufan.big.ac.cn/AgePrediction/）[23-24]，进而应用于刑事科学技术年龄推断；焦磷酸测序数据则必须首先将检测数据进行Z-score转化才能得到相对准确的预测结果，而单个样本无法进行Z-score转化以及样本太少会造成较大的Z-score转化误差，因此在利用Z-score转化模型时需要时间积累焦磷酸平台样本数据，但这对于实际的案件应用所面临的迫切性是矛盾的。针对这个问题，我们建议目前统一使用MassARRAY进行DNA甲基化水平检测。另外，随着时间的积累，当积累了足够多的焦磷酸测序数据后，重新训练一个针对焦磷酸测序检测方法的年龄预测模型不失为一个更好的解决方案，并对比两种方法的年龄预测成效，从而使甲基化推断年龄在刑事技术方面发挥更大的作用。
本文编号：3397952
【文章来源】：南方医科大学学报. 2020,40(12)北大核心CSCD
【文章页数】：7 页
【部分图文】：
MassARRAY和焦磷酸测序的CpG位点的甲基化水平比较
本项研究进一步证明不同的甲基化检测方法存在系统性差异，而且这种差异可以通过Z-score转换算法得到有效降低。通过Z-score转换技术可以有效的将利用焦磷酸测序DNA甲基化数据进行年龄预测的误差降低到同MassARRAY相似的水平。但是，由于目前的年龄预测模型是基于MassARRAY数据构建的，因此对于MassARRAY检测的数据，可以直接通过我们已发表的年龄预测网站进行年龄推断（http://liufan.big.ac.cn/AgePrediction/）[23-24]，进而应用于刑事科学技术年龄推断；焦磷酸测序数据则必须首先将检测数据进行Z-score转化才能得到相对准确的预测结果，而单个样本无法进行Z-score转化以及样本太少会造成较大的Z-score转化误差，因此在利用Z-score转化模型时需要时间积累焦磷酸平台样本数据，但这对于实际的案件应用所面临的迫切性是矛盾的。针对这个问题，我们建议目前统一使用MassARRAY进行DNA甲基化水平检测。另外，随着时间的积累，当积累了足够多的焦磷酸测序数据后，重新训练一个针对焦磷酸测序检测方法的年龄预测模型不失为一个更好的解决方案，并对比两种方法的年龄预测成效，从而使甲基化推断年龄在刑事技术方面发挥更大的作用。
甲基化的定量检测分为3步：亚硫酸氢盐转化、PCR扩增、甲基化测定。MassARRAY和焦磷酸测序在技术原理方面存在差异，其差异重点是第三步甲基化测定。首先检测前对基因组DNA进行亚硫酸氢盐转化[26],DNA中未甲基化的胞嘧啶（C）转变为尿嘧啶（U），而甲基化的胞嘧啶（C）保持不变，因此将甲基化的差异变为序列的差异。亚硫酸氢盐转换后进行PCR扩增，将序列差异性成比例的放大后用于下一步的甲基化定量检测。在甲基化测定中，MassARRAY和焦磷酸测序技术均需要4～5个小时完成定量检测，而且都被用于法庭科学年龄推断研究[16,27]，但是两种方法检测原理不同。MassARRAY结合了碱基特异性酶切反应和MALDI-TOF检测原理，可实现多个CpG的分析检测，碱基特异性酶切实验由亚硫酸氢盐处理待测DNA开始，经过亚硫酸氢盐处理，由此在DNA模板中产生甲基化特异的序列变化；利用5"末端带有T7-启动子的引物进行PCR扩增，产物经SAP处理后用于碱基特异性的酶切反应；酶切后DNA片段的大小和分子量取决于亚硫酸氢盐处理后的碱基变化，飞行质谱能测出每个片段的分子量，配套软件MassARRAY EpiTYPER则能自动报告每个相应片段的甲基化程度[27-28]。焦磷酸测序是一种新的DNA序列分析技术，是在同一反应体系中由4中酶催化的酶级联化学发光反应。特异性引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4种酶的协同作用下，将每一个d NTP的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来，荧光信号的强度与结合的核苷酸数目成比例，然后通过荧光检测装置检测荧光的释放和强度，并通过软件将光信号转换为峰图。反应底物为5-磷酰硫酸和荧光素，反应体系包括待测序DNA单链和测序引物。每一轮测序反应中，加入1种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶可将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸集团；硫酸化酶催化APS和PPi形成ATP，后者驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素转化，发出与ATP量成正比的可见光信号，并由Pyrogram转化为一个峰值，其高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比；根据加入dNTP类型和荧光信号强度就可实时记录模板DNA的核苷酸序列[29-30]。在本研究中，选取了两个批次且相互独立的样本，分别使用MassARRAY和焦磷酸测序对9个甲基化位点进行检测，并进行了个体年龄推断分析。结果显示，进行Z-score转换前后，MassARRAY测得的MAD值差异不明显；焦磷酸测序数据由MAD=4.20年降低为MAD=2.76年，可以更加准确的预测年龄，因此，Z-score转换能够有效降低MassARRAY和焦磷酸测序数据之间的系统性批次效应。本项研究进一步证明不同的甲基化检测方法存在系统性差异，而且这种差异可以通过Z-score转换算法得到有效降低。通过Z-score转换技术可以有效的将利用焦磷酸测序DNA甲基化数据进行年龄预测的误差降低到同MassARRAY相似的水平。但是，由于目前的年龄预测模型是基于MassARRAY数据构建的，因此对于MassARRAY检测的数据，可以直接通过我们已发表的年龄预测网站进行年龄推断（http://liufan.big.ac.cn/AgePrediction/）[23-24]，进而应用于刑事科学技术年龄推断；焦磷酸测序数据则必须首先将检测数据进行Z-score转化才能得到相对准确的预测结果，而单个样本无法进行Z-score转化以及样本太少会造成较大的Z-score转化误差，因此在利用Z-score转化模型时需要时间积累焦磷酸平台样本数据，但这对于实际的案件应用所面临的迫切性是矛盾的。针对这个问题，我们建议目前统一使用MassARRAY进行DNA甲基化水平检测。另外，随着时间的积累，当积累了足够多的焦磷酸测序数据后，重新训练一个针对焦磷酸测序检测方法的年龄预测模型不失为一个更好的解决方案，并对比两种方法的年龄预测成效，从而使甲基化推断年龄在刑事技术方面发挥更大的作用。
本文编号：3397952
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