血凝酶—脂质体—微泡复合物的制备及其体外凝血的实验研究

发布时间：2017-05-20 15:13

  本文关键词：血凝酶—脂质体—微泡复合物的制备及其体外凝血的实验研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景： 活动性出血是腹部实质脏器闭合性创伤急性致死的主要因素之一。目前常用的方法止血方法有外科手术、选择性动脉栓塞以及射频凝固等方法,但是它们具有的愈后差、操作复杂以及容易损伤创伤部位周围正常组织等缺陷。因此我们拟探索一种更为简便、有效以及无创的止血方式控制活动性出血。我们拟通过一种载体运载止血剂到达活动性出血部位,通过低机械指数超声发现活动性出血部位,而后通过聚焦超声激发载体释放止血剂,从而达到止血目的。脂质体-微泡复合物集合了脂质体以及微泡的优势,既可以超声显影又可以运载药物被超声激发释药,然而将其用于止血的研究尚不多见。本研究拟采用此载体,将血凝酶包封于脂质体内并通过亲和素-生物素系统将其与微泡相连,制备载止血剂的脂质体-微泡复合物,为实现腹部实质脏器闭合性创伤活动性出血的一体化诊疗新方法奠定基础。 第一章脂质体包封血凝酶的实验研究 研究目的： 研究脂质体包封血凝酶的可行性。 材料和方法： 1两种逆相蒸发法的选择 以DPPC (1,2-Dipalmitoyl-Sn-Glycero-3-Phosphocholine,二棕榈酰磷脂酰胆碱)、CH (Cholesterol,胆固醇)、DSPE-PEG2000Biotin (1,2-Distearoyl-Sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-N-[Biotinyl (Polyethylene Glycol)-2000],生物素酞化聚乙二醇2000修饰二硬脂酸磷酯酰乙醇胺)为原料,通过两种逆相蒸发法包封血凝酶,检测所得脂质体的粒径,并对脂质体悬液的外观进行观察,初步评估脂质体浓度。4℃储存12h、24h、36h后观察脂质体悬液外观变化,从而确定本实验所用血凝酶的包封方法。 2脂质体包封血凝酶 将血凝酶冻干粉末溶解于去离子水中,于4℃进行透析处理,透析4.5h。将DPPC、CH、DSPE-PEG2000Biotin粉末以摩尔比60：40：5完全溶解于三氯甲烷中,加入15%三氯甲烷体积的无水乙醚。加入有机溶剂1/3体积的血凝酶溶液。对混合液进行声振处理4min。将混合液真空条件下干燥处理1h。取干燥后混合液,14000g离心处理30min。取下层乳白色凝胶物以11mmol/1旨质浓度溶解于去离子水,充分混合均匀。 3理化性质检测 通过纳米粒度及电位分析仪检测血凝酶-脂质体的粒径以及表面电位；将血凝酶-脂质体悬液分别于室温(25℃)及4℃静置12h、24h、36h、48h,观察脂质体悬液有无浑浊、沉淀及分层；梯度稀释血凝酶溶液,按照BCA(Bicinchoninic Acid,二喹啉甲酸)蛋白浓度测定的方法,于562nm检测吸光度,绘制血凝酶的标准曲线。通过公式计算包封率： W总代表脂质体悬液加入终浓度为1%的Triton X-100水溶液处理后至脂质体完全破裂溶液中的药物总量。W游离代表未经过处理前悬液中未包封的药物含量。 结果： 第二种逆相蒸发法包封1单位/ml血凝酶的脂质体的浓度第一种逆相蒸发法包封2单位/ml血凝酶的脂质体的浓度第一种逆相蒸发法包封1单位/ml血凝酶的脂质体的浓度。第一种逆相蒸发法包封2单位/m1血凝酶的脂质体的粒径第一种逆相蒸发法包封1单位/m1血凝酶的脂质体的粒径第二种逆相蒸发法包封1单位/ml血凝酶的脂质体的粒径。本研究选择第二种逆相蒸发法制备血凝酶-脂质体,通过此方法获得的血凝酶-脂质体悬液呈均一半透明状态,平均粒径约(431.95±19.04)nm,表面电位为(-22.13±0.35)mv,并于室温(25℃)及4℃静置48h内无浑浊、沉淀及分层。 结论： 血凝酶可以通过逆相蒸发法被脂质体包封,粒径为纳米级,表面带负电,具有良好的稳定性,包封率为35.08%,为与微泡相连奠定了基础。 第二章亲和素-生物素法连接血凝酶-脂质体与微泡的实验研究 研究目的： 研究亲和素-生物素系统对连接血凝酶-脂质体与微泡的价值。 材料和方法： 1生物素化微泡的制备 将DSPC (1,2-Distearoyl-Sn-Glycero-3-Phosphatidylcholine,二硬脂酰磷酯酰胆碱)、DSPE-PEG2000(1,2-Distearoyl-Sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-N-[Methoxy(Polyethylene Glycol)-2000],聚乙二醇2000-二硬脂酸磷酯酰乙醇胺)、DSPE-PEG2000Biotin粉末以摩尔比90：5：5完全溶解于三氯甲烷中。将脂质溶液于65℃进行水浴处理,同时氮气流下吹干处理,形成均匀脂质薄膜。对脂质薄膜干燥处理至完全干燥。将Tris缓冲液加入脂质薄膜内。将水合后的脂质溶液于65℃恒温进行声振处理。反复多次将C3F8(Perfluoropropane,全氟丙烷)通入溶液中直至呈饱和状态。通过机械振荡换气后的脂质溶液,形成生物素化微泡。 2生物素化微泡的理化性质检测 通过颗粒计数分析仪检测生物素化微泡的粒径及浓度；通过纳米粒度及电位分析仪检测生物素化微泡的表面电位；通过倒置系统显微镜明视野下观察生物素化微泡的形态与分布；将生物素化微泡放置于4℃储存,分别于制备后即刻、24h、48h、72h、1周后,通过颗粒计数分析仪检测生物素化微泡的粒径及浓度变化。 3血凝酶-脂质体与生物素化微泡的连接及验证 3.1磁性微泡的制备及磁性吸附观察 将纯化后的生物素化微泡与亲和素孵育连接后,再与等体积的生物素化的右旋糖苷氧化铁纳米粒孵育30min,得到磁性微泡。 将磁性微泡注入透明软管内,将透明软管静置5min,用超声实时分子影像系统实时观察磁性微泡的运动变化及显影情况。在与磁性微泡运动方向相反的方向放置永磁铁。待永磁铁放置5min后,观察磁性微泡的运动变化及显影情况。采用PBS (Phosphate Buffered Saline,磷酸盐缓冲液)作为空白对照。 3.2FITC标记血凝酶的脂质体-微泡复合物的制备及连接观察 将2单位/1的血凝酶溶液与1mmol/1的FITC (Fluorescein Isothiocyanate,异硫氰酸荧光素)水溶液于4℃避光孵育10h。而后透析处理。将DPPC、CH、DSPE-PEG2000Biotin粉末以摩尔比60：40：5溶解于三氯甲烷中,加入15%三氯甲烷体积的无水乙醚。加入有机溶剂1/3体积的FITC标记的血凝酶溶液。对混合液进行声振处理4min。将混合液真空条件下干燥处理1h。取干燥后混合液14000g离心处理30min。取下层黄绿色凝胶物以11mmol/1脂质浓度溶解于去离子水,充分混合均匀。将1m1生物素化微泡用去离子水以300g离心3min,洗涤4次。而后将生物素化微泡与过量亲和素溶液孵育15min。用去离子水以300g离心3min,洗涤4次。将上述已连接亲和素的生物素化微泡与500u1FITC标记血凝酶的脂质体悬液孵育15min。用去离子水将上述FITC标记血凝酶的脂质体-微泡复合物悬液以300g离心3min,洗涤数次,直至洗涤液澄清,呈无色。 将FITC标记血凝酶的脂质体-微泡复合物经过去离子水稀释后,于倒置系统显微镜下进行形态及荧光性观察。 4血凝酶-脂质体与微泡添加比例的实验 纯化生物素化微泡,将其与亲和素连接。将连接亲和素后的等量生物素化微泡分别与250μl和500μl血凝酶-脂质体悬液孵育,得到血凝酶-脂质体-微泡复合物,并纯化血凝酶-脂质体-微泡复合物。对其粒径及浓度进行检测,从而分析生物素化微泡与血凝酶-脂质体比例对血凝酶-脂质体-微泡复合物的粒径及浓度的影响。 5血凝酶-脂质体-微泡复合物的理化性质检测 将血凝酶-脂质体-微泡复合物置于颗粒计数分析仪内进行粒径及浓度检测。将血凝酶-脂质体-微泡复合物经过去离子水稀释后加入纳米粒度及电位分析仪内进行表面电位检测。将纯化后的血凝酶-脂质体-微泡复合物经过去离子水稀释后于倒置系统显微镜明视野下观察其形态与分布。取血凝酶-脂质体-微泡复合物共400μl,每100μl吸入1ml注射器内,将4只注射器分别以0、125μl/min,500μl/min,1000μl/min的速度进行推注,并收集推注后的悬液,取悬液下层清液,将其与BCA蛋白浓度测定试剂反应后,于562nm检测吸光度,从而分析推注速度对血凝酶-脂质体-微泡复合物的稳定性的影响。将血凝酶-脂质体-微泡复合物(浓度数量级为109个/ml)及用去离子水分别稀释10倍(浓度数量级为108个/ml)、100倍(浓度数量级为107个/ml)、103倍(浓度数量级为106个/ml)、104倍(浓度数量级为105个/ml)、105倍(浓度数量级为104个/ml)、106倍(浓度数量级为103个/ml)后装入7组透明离心管内,另外将1组透明离心管内装入等量去离子水作为空白对照组。对8组透明离心管进行超声实时显影,实时记录和观察血凝酶-脂质体-微泡复合物随浓度变化的显影特点,并通过各组感兴趣区的灰阶值测量对血凝酶-脂质体-微泡复合物的声学性质进行评价。 结果： 生物素化微泡的平均粒径约为(1.11±0.21)μm,浓度约为(2.79±1.64)×109个/m1,表面电位为(-24.10±1.01)mv,显微镜下呈圆形,中心透亮,分布较均匀,无粘附聚集。4℃下,其粒径随着时间变化而逐渐增大,浓度随着时间变化而逐渐减低。 磁性微泡具有超声增强显影效果并且因为具有顺磁性而可以被永磁铁吸附移动。FITC标记血凝酶的脂质体-微泡复合物于荧光激发下可见呈圆形,中心透亮,外周被黄绿色荧光所包绕,这些结果证实亲和素-生物素系统可以将血凝酶-脂质体与生物素化微泡进行有效的连接。 等量生物素微泡连接250u1和500u1血凝酶-脂质体对血凝酶-脂质体-微泡复合物的粒径的影响无显著性意义。本实验最终选用500μl血凝酶-脂质体悬液加入量制备血凝酶-脂质体-微泡复合物。所得血凝酶-脂质体-微泡复合物的平均粒径约为(4.01±0.40)u m,浓度约(1.80±0.48)×109个/ml,表面电位为(-27.87±0.68)mv。显微镜下呈圆形,中心透亮,分布较均匀,无粘附聚集。125μl/min以内的推注速度引起血凝酶-脂质体-微泡复合物的渗漏可以忽略不计,而500μl/min、1000μl/min的推注速度均可以引起血凝酶-脂质体-微泡复合物的明显渗漏。将血凝酶-脂质体-微泡复合物稀释100倍(浓度数量级为107个/ml)、103倍(浓度数量级为106个/ml)、104倍(浓度数量级为105个/ml)时为适宜显影浓度,增强回声均匀,既不会因为声影产生而影响图像显影,也不会因为浓度过度导致灰阶值变化明显。 结论： 亲和素-生物素系统是一种有效的连接方式,它可以将包封血凝酶的脂质体牢固地连接于微泡表面,形成的血凝酶-脂质体-微泡复合物,理化性质较稳定。 第三章超声激发血凝酶-脂质体-微泡复合物体外凝血实验研究目的： 研究超声激发血凝酶-脂质体-微泡复合物释药体外凝血的效果。材料和方法： 将1m1生物素化微泡以300g离心3min,洗涤4次。将纯化后的生物素化微泡与过量的亲和素溶液孵育15min。以300g离心3min,洗涤4次,离心洗涤过量游离亲和素。将连接亲和素后的生物素化微泡与500μl血凝酶-脂质体悬液孵育15min得到血凝酶-脂质体-微泡复合物。以300g离心3min,洗涤4次纯化。 将血凝酶-脂质体-微泡复合物用去离子水稀释10倍后取100u1,通过2.25MHz聚焦超声用4.17w/cm2和8.34w/cm2分别对血凝酶-脂质体-微泡复合物激发30s,加入450μl兔血浆。而后加入40mg/ml CaCl2(Calcium Chloride,氯化钙)启动凝血过程,分别于25℃和37℃用1m1注射器的针头在同样的方向和深度以挑取纤维蛋白为标准计算凝血时间。以去离子水及血凝酶-脂质体-微泡复合物不通过超声处理组作为对照组。 结果： 凝血时间：去离子水组血凝酶-脂质体-微泡复合物组血凝酶-脂质体-微泡复合物通过4.17w/cm2超声激发组血凝酶-脂质体-微泡复合物通过8.34w/cm2超声激发组。25℃时的凝血时间37℃时的凝血时间。血凝酶-脂质体-微泡复合物能够缩短凝血时间,对血凝酶-脂质体-微泡复合物进行超声激发处理后,超声可以激发微泡促进相连的脂质体释放被包封的血凝酶。此连接方式并没有影响血凝酶的凝血功能,并且超声处理时增大声强(8.34w/cm2),能够增加药物释放,而表现为进一步缩短凝血时间。此外,37℃的体外凝血实验较25℃时相比具有更明显的实验效果。 结论： 血凝酶-脂质体-微泡复合物在聚焦超声激发下可以明显缩短凝血时间,37℃的体外凝血实验较25℃时相比具有更明显的实验效果,该结果为后期的动物实验奠定了基础。
【关键词】：脂质体 血凝酶 逆相蒸发法 脂质体 微泡 血凝酶 亲和素 生物素 超声 脂质体 微泡 血凝酶 凝血
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R656.1;R816.5
【目录】：

• 摘要3-12
• ABSTRACT12-25
• 前言25-30
• 第一章 脂质体包封血凝酶的实验研究30-43
• 1 材料与方法30-33
• 2 结果33-39
• 3 讨论39-42
• 4 结论42-43
• 第二章 亲和素-生物素法连接血凝酶-脂质体与微泡的实验研究43-63
• 1 材料与方法43-48
• 2 结果48-59
• 3 讨论59-62
• 4 结论62-63
• 第三章 超声激发血凝酶-脂质体-微泡复合物体外凝血实验63-68
• 1 材料和方法63-65
• 2 结果65-66
• 3 讨论66-67
• 4 结论67-68
• 参考文献68-75
• 缩略词表75-76
• 攻读学位期间所取得成果76-79
• 致谢79-80

【参考文献】

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本文编号：382003