大剂量辐射诱导IEC-6细胞差异表达基因的克隆与筛选

发布时间：2024-03-14 04:58

　　目的： 肠上皮细胞是构筑肠道粘膜屏障的主要部分，还具有分泌、吸收等多种功能，在维持机体生命活动中居重要的地位。在核爆炸、核事故等多种情况下可发生病死率极高的肠型放射病，目前尚无有效的救治方法。肠上皮细胞是辐射敏感细胞，受一定剂量照射后，可发生增殖抑制、结构异常、坏死脱落，而且具有克隆形成能力的隐窝干细胞不能存活和重建小肠的隐窝、绒毛系统，导致肠道屏障的破坏以及修复困难，成为肠型放射病的根本原因。由于在体分离纯化隐窝干细胞存在技术困难，目前学者大都使用具有隐窝未分化细胞特点的细胞株IEC-6作为体外研究模型。本研究利用IEC-6细胞进行大剂量辐射诱导的差异表达基因的筛选，旨在为肠上皮细胞的辐射损伤修复的分子机制研究提供新的靶点，为放射性胃肠综合症提供新的治疗线索，同时将对细胞的增殖、分化、凋亡和转化等基本的生命问题提供启示和答案。 方法： 本研究以35Gyγ射线照射后24h的IEC-6细胞株为模型，分为两个部分进行。第一部分：大剂量辐射诱导IEC-6细胞差异表达基因消减cDNA文库的构建。包括以下内容：1）常规IEC-6细胞培养，传代致一定数量，待细胞处于对数生长期时，随机选取一半设为照...

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图2实验方和驱动方双链cDNARsaI酶切前后Lane1:正常组酶切前Lane2:正常组酶切后Lane3:照射组酶切前Lane4:照射组酶切后

平台期从而确定最佳循环数为21cycles并合成了足量的双链cDNA(见照片6)经RsaI酶切3h后于1%的琼脂糖/EB凝胶上电泳分析酶切效果结果表明酶切后片段大小分布在0.1-2kb之间(见图2和照片7)明显比未经酶切的对照短荧光smear带重心....

图1RNA甲醛变性琼脂糖凝胶电泳Lane1:正常组IEC-6细胞总RNALane2:照射组IEC-6细胞总RNA

图2实验方和驱动方双链cDNARsaI酶切Lane1:正常组酶切前Lane2:正常组酶切Lane3:照射组酶切前Lane4:照射组酶切LaneM:mark1RNA甲醛变性琼脂糖凝胶电泳ne1:正常组IEC-6细胞总RNAane2:照射组IE....

图4正向消减杂交第一次PCR和第二次PCR产物

第三军医大学硕士学位论文图2实验方和驱动方双链cDNARsaI酶切前后Lane1:正常组酶切前Lane2:正常组酶切后Lane3:照射组酶切前Lane4:照射组酶切后胶电泳RNARNA

图6.克隆U20的正向Northernblot分析

讨论然可以使差异表达序列得到有效的富集但是存在相当行进一步筛选传统的差异表达基因的筛选方法是将菌杂交但当成分复杂的筛选探针和滤膜杂交时容易受而形成非特异结合使检测稀有转录子克隆非常困难7年建立了一套高通量的差异基因筛选方法通过菌落的插入片段碱变性后交联在尼龙....

本文编号：3928096