沉默DNA-PKcs、ATM表达对HeLa细胞生物学行为及放疗敏感性的影响
本文关键词：沉默DNA-PKcs、ATM表达对HeLa细胞生物学行为及放疗敏感性的影响，由笔耕文化传播整理发布。
【摘要】：研究背景宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤,发病率在女性所有恶性肿瘤中居第4位,但是在部分发展中国家,由于宫颈癌筛查不到位,其发病率可以居女性恶性肿瘤首位。据统计全世界每年约有新发宫颈癌患者528,000例,因宫颈癌导致的死亡约为266,000例,其中85%左右发生在发展中国家。宫颈癌是唯一明确病因的恶性肿瘤,持续的高危HPV感染是导致宫颈癌的原因,其中HPV16/18两种病毒感染导致的宫颈癌占宫颈癌总数的80%左右。目前宫颈癌的治疗主要包括手术、放疗和化疗。放疗是宫颈癌的重要治疗方法,特别对晚期宫颈癌患者。放射线能引起细胞DNA双链断裂(DSB),如果不能及时修复可导致细胞死亡。细胞中存在着对其存活至关重要的DNA损伤修复通路。肿瘤细胞对放疗导致DNA损伤的修复能力是引起其对放疗不敏感的重要原因。目前较为公认的DSB修复机制主要有两种:非同源末端连接(NHEJ)修复和同源重组(HR)修复,哺乳动物细胞以NHEJ修复为主。DNA-PKcs和ATM分别在NHEJ和HR修复中起重要作用。临床研究表明DNA-PKcs和ATM高表达的肿瘤患者疾病进展较快,对放疗不敏感,预后较差。细胞实验表明,通过RNA干扰抑制癌细胞DNA-PKcs或ATM的表达能增加其对放疗的敏感性,并且对其部分恶性生物学行为有一定影响。但是还没有研究同时抑制DNA-PKcs和ATM表达检测其对宫颈癌细胞恶性生物学行为及放疗敏感性的影响。研究目的探讨抑制hela细胞dna-pkcs、atm的表达后,对其生物学行为及放疗敏感性的影响。材料与方法1.构建干扰质粒:将针对dna-pkcs和atm的干扰rna分别及同时连入质粒,合成含针对dna-pkcs、atm及dna-pkcs+atm的干扰质粒。2.筛选稳定转染的细胞株及检测沉默效果:将干扰质粒分别转染hela细胞,嘌吟霉素筛选出稳定转染的细胞株。用westernblot和quantitativereal-timepcr检测未转染的hela细胞组(对照组),转染干扰dna-pkcs表达hela细胞组(dna-pkcs组),转染干扰atm表达hela细胞组(atm组)和转染同时干扰dna-pkcs+atm表达hela细胞组(dna-pkcs+atm组)的dna-pkcs和atm蛋白和mrna表达水平,检测沉默效果。3.cck8检测对照组、单独及同时沉默dna-pkcs、atm对hela细胞增殖活性的影响。4.流式细胞仪检测对照组、单独及同时沉默dna-pkcs、atm对hela细胞凋亡的影响。5.transwell小室侵袭模型检测对照组、单独及同时沉默dna-pkcs、atm对hela细胞侵袭能力的影响。6.克隆形成实验检测对照组、单独及同时沉默dna-pkcs、atm对hela细胞放疗敏感性的影响。7.数据统计分析:数据采用spss17.0统计软件分析。计量资料均进行正态性、方差齐性检验,符合正态性条件的结果以均数±标准差(x±s)表示,各组间比较采用方差分析或者非参数检验,组间两两比较用snk(student-newman-keuls,snk)法。所有统计检验均为双侧概率检验,p0.05为差异有统计学意义。结果1.筛选稳定转染的细胞系及对沉默效果的检测:使用含嘌呤霉素的梯度培养基培养2周,确定嘌呤霉素对hela细胞的最佳筛选浓度为0.8ug/ml。然后用此浓度的筛选培养基培养转染后的hela细胞,筛选出稳定转染的克隆。通过westernblot和quantitativereal-timepcr分别从蛋白水平和mrna水平检测各组细胞中dna-pkcs和atm量的变化,结果显示:dna-pkcs组和ATM+DNA-PKcs组的DNA-PKcs mRNA和蛋白水平均较其它组下降,差异有统计学意义(P0.05);ATM组和DNA-PKcs+ATM组ATM蛋白和mRNA均较其它组表达下降,差异有统计学意义(P0.05)。2.细胞增殖实验结果显示:在24 h、48 h、72 h、96 h四个时间点,ATM+DNA-PKcs组增殖活性较对照组低,差异分别有统计学意义(P0.05);在48 h、72 h、96 h各个时间点时,ATM+DNA-PKcs组增殖活性较ATM组低,DNA-PKcs组较对照组增殖活性低,差异分别有统计学意义(P0.05);在72h、96 h各个时间点时,ATM+DNA-PKcs组较DNA-PKcs组增殖活性低,ATM组较对照组增殖活性低,差异均有统计学差异(P0.05);在96h时,DNA-PKcs组较ATM组增殖活性低,差异有统计学意义(P0.05)。余差异无统计学意义(P0.05)。3.细胞凋亡实验结果显示:ATM+DNA-PKcs组较DNA-PKcs组、ATM组及对照组凋亡增加,差异有统计学意义(P0.05);DNA-PKcs组较ATM组和对照组凋亡增加,有统计学差异(P0.05),其余差异无统计学意义(P0.05)。4.Transwell小室侵袭实验结果显示:实验组较对照组穿过基质胶细胞数少,差异存在统计学意义(P0.05),其中ATM+DNA-PKcs组的穿过基质胶细胞数最少;ATM+DNA-PKcs组较ATM组和DNA-PKcs组穿过基质胶细胞数少,差异有统计学意义(P0.05),其余则无统计学意义(P0.05)。5.放疗敏感性实验结果显示:在2,4,6 Gy三个放射线剂量时,实验组较对照组克隆形成率低,且ATM+DNA-PKcs组较DNA-PKcs组和ATM组克隆形成率低,差异均有统计学意义(P0.05);在6Gy时DNA-PKcs组较ATM组克隆形成率低,差异有统计学意义(P0.05);余差异无统计学意义(P0.05)。结论1.DNA-PKcs对HeLa细胞增殖、凋亡及放疗敏感性的影响较ATM明显。2.同时沉默宫颈癌HeLa细胞DNA-PKcs和ATM表达较单独沉默DNA-PKcs或ATM,能更有效的增加HeLa细胞凋亡,抑制增殖和侵袭,特别是能明显增加其放疗敏感性。
【关键词】：HeLa细胞 DNA-PKcs ATM 生物学行为 放疗敏感性
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.33;R730.55
【目录】：
- 摘要4-7
- Abstract7-12
- 英文缩略词12-14
- 引言14-18
- 材料与方法18-30
- 结果30-37
- 讨论37-42
- 结论42-43
- 参考文献43-48
- 综述 RNAI与宫颈癌放疗敏感性相关基因的研究进展48-60
- 参考文献55-60
- 个人简历60-61
- 致谢61
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