可用以评价子宫内膜容受性的KDR单抗脂质声学造影剂的制备及靶向结合实验研究

发布时间：2017-06-26 16:16

  本文关键词：可用以评价子宫内膜容受性的KDR单抗脂质声学造影剂的制备及靶向结合实验研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景与目的 子宫内膜容受性是指子宫内膜处于一种允许胚泡黏附直至完成胚胎着床的状态。在月经周期中子宫内膜仅有一段时间允许胚胎着床,一般为黄体中晚期,其受严格的时间和空间限制,一般仅为排卵后的6-8天,持续不到48小时,临床上也称为子宫内膜“种植窗”期。体外受精-胚胎移植(in vitrofertilization-embryo transfer, IVF-ET)技术为不孕症患者提供了福音,但在临床实际工作中,即使应用相当高的技术筛选了相对优质的受精卵,即体外受精及胚泡移植入子宫的成功率在90%以上,但胚胎种植的成功率一般仅为30%-40%。有研究表明60%以上胚胎种植失败的因素归因于不合适的子宫内膜容受性。如何客观评价“种植窗”期子宫内膜容受性,避免盲目移植,以提高胚胎着床率是生殖医学界关注的热点问题之一。 现阶段评价子宫内膜容受性的方法有多种,子宫内膜活检随后进行组织及相关生物学指标的测定是临床较公认的评估方法,但其为有创性检查,在IVF-ET周期中不具可操作性。宫腔灌洗液、宫颈粘液生物标记物的测定,血液特殊激素表达测定及基因标记现阶段也有应用,但缺乏相应准确而又敏感的指标或价格昂贵、技术要求较高。彩色多普勒超声技术可作为一种无创手段测定子宫血流灌注情况来评价子宫内膜容受性,但其敏感性、特异性学术界尚存在争议。寻找一种既无创、又能客观评价子宫内膜容受性的方法以提高胚胎种植率是一个亟待解决的问题。 Kodaman等多位学者证实,多种细胞因子和生长因子在黄体中晚期短暂、瞬间性高表达,具有显著的时空表达特征,且定位较专一,参与胚胎着床过程,如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，，VEGF)、白血病抑制因子、整合素、白细胞介素、表皮生长因子等。在受精卵着床、胚胎植入过程中,血管的成熟无疑是最重要的,VEGF是子宫血管发育重要的调节因子之一。Kaczmarek等研究发现,动物“种植窗”期子宫内膜VEGF及其受体flk-1/KDR均显著上调,且VEGF及其受体的表达部位存在从子宫内膜普遍表达到着床位点局部高表达的转变,提示VEGF可作为植入胚胎与接受状态子宫内膜的血管结构之间的局部信号分子。Hwu YM等证实VEGF与受体flk-1/KDR结合后发挥多种生物学功能,以利于胚胎着床,如血管内皮细胞增殖、血管生成、增加血管通透性、介导信号转导、改变内皮细胞基因的表达、调节子宫内膜生长等。“种植窗”期子宫内膜VEGF及其受体flk-1/KDR表达均显著增加,表达定位于上皮细胞、基质细胞、子宫肌层和血管内皮细胞,以促进血管生成、重构、扩张以及增加血管通透性,这一过程是胚胎成功种植的必要条件。Sengupta等证明于排卵后5-10天给予恒河猴VEGF拮抗剂后,其临床妊娠率较对照组显著下降。以上实验表明VEGF及受体KDR的表达水平对评价子宫内膜容受性具有重要意义。 靶向超声造影剂是近年来萌芽的一项新兴研究领域,并逐渐成为国际上探讨的热点课题。靶向超声微泡表面携带的特异性抗体或配体能与靶细胞表面的抗原或受体结合,超声检测靶向造影剂在组织和器官中的分布,可获得组织和器官的分子学特征,称之为“超声分子学成像”,是一种无创检测分子水平的成像技术,其在炎症、血栓、心肌缺血、肿瘤等诸多方面均展示了一些十分诱人的前景。以子宫内膜血管组织的KDR为靶点进行靶向特异性显影而评价子宫内膜容受性的研究,国内外尚未见报道。 本研究拟利用超声分子影像学优势,以KDR为靶目标,借助生物素-亲和素桥,制备携KDR单抗的靶向超声造影剂(Microbubblles-Biotin-Avidin-Biotin-KDR, MB-BAB-KDR),并通过体内外的靶向结合实验来探讨其在评价子宫内膜容受性中的价值。材料与方法 1MB-BAB-KDR的制备及生物活性测定 1.1普通生物素化脂质微泡(MB-B)的制备 将生物素化二硬脂酞磷脂酞乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG-2000-Biotin)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DistearoylsnGlyeeroPhosPhoethanola, DPPC)、聚乙二醇-4000(PEG-4000)、泊洛沙姆等材料,参照文献,按一定比例溶于蒸馏水中,在75℃恒温水浴箱上摇匀使其充分溶解；通入全氟丙烷(C3F8)气体,机械振荡法振荡至成为乳白色液体；4℃度静置分层,弃下清液,纯化微泡三次收集上层白色微泡,制得MB-B。 1.2生物素-亲和素桥连的靶向脂质微泡(MB-BAB-KDR)及单纯单抗脂质微泡(MB-B-KDR)制备 按一定比例向MB-B中加入亲和素,冰上孵育30min,洗涤纯化3次后,再加入一定比例的生物素化KDR单抗,静置后洗涤纯化3次,制得生物素-亲和素桥连的靶向脂质微泡MB-BAB-KDR。向MB-B中直接加入相同比例的生物素化KDR单抗,静置后洗涤纯化3次,制得单纯单抗脂质微泡MB-B-KDR。所有微泡盛于安剖瓶内,于4℃冰箱内保存、备用。1.3光学显微镜及库尔特粒径分析仪测定微泡物理性质 将载玻片及盖玻片擦拭干净,轻轻用注射器将微泡悬液吸出少许,滴在载玻片中央,并将盖玻片盖在载玻片上；使悬液充满盖玻片和载玻片之间,倒置并静置3min,使其靠浮力作用附于载玻片上；普通光学显微镜下观察微泡的镜下形态。另外用注射器吸取MB-B、MB-B-KDR、MB-BAB-KDR三种微泡悬浮溶液各1ml,以1：10000比例稀释,取2ml微泡上机,库尔特颗粒粒度分析仪测定微泡粒径、浓度及粒径分布情况。 1.4MB-BAB-KDR生物活性的测定 分别取MB-BAB-KDR、MB-B-KDR、MB-B各lml与等量FITC标记的羊抗大鼠IgG(H+L)(简称二抗)孵育,洗涤纯化3次后,荧光显微镜下观察三种微泡与二抗的结合情况。依据以下目测标准对荧光强度进行分级：0级：未见明显荧光；Ⅰ级：可见到荧光,但荧光微弱或暗淡；Ⅱ级：可见明亮荧光。 2MB-BAB-KDR的体外特异性结合及黏附稳定性实验 2.1脐静脉内皮细胞(IUVECs)KDR的表达检测 2.1.1流式细胞实验法检测HUVECs的KDR表达 将由南方医科大学病理实验室提供的HUVECs复苏、培养,取生长对数期的HUVECs,用0.25%胰酶消化成单细胞悬液加入离心管中,离心弃上清液并洗涤1次；加入稀释的KDR单克隆抗体200μl吹打混匀,置4℃孵育30min,离心洗涤弃上清液3次；再加入FITC标记的二抗200μl,吹打混匀,4℃避光孵育30min,离心洗涤弃上清液3次；将细胞重新悬浮于500ul蒸馏水中,置流式管中应用流式细胞仪检测HUVECs的KDR表达情况,以同等量的HUVECs悬浮为对照组。 2.1.2免疫组化法检测HUVECs的KDR表达 取生长对数期HUVECs,用0.25%胰酶消化后,接种于6孔板中玻片上,加含10%胎牛血清DMEM全培液,5%C02培养箱孵育,直至细胞80%饱和,PBS洗涤3次,4%多聚甲醛固定,行常规KDR免疫荧光检测。2.2MB-BAB-KDR与HUVECs的体外特异性结合实验 用荧光染料DiI给生长良好的传代]SUVECs着色,着色细胞继续传代培养至下一代细胞,在六孔板中培养制作细胞爬片,分别用MB-BAB-KDR、 MB-B-KDR、MB-B与爬片上的HUVECs孵育30min,漂洗六次,光镜及荧光显微镜观察微泡与细胞结合情况。取10个随机视野的细胞进行观察,每个细胞结合5个或以上的微泡视为花环形成阳性,荧光显微镜下观察花环形成情况,计算花环形成率,计数资料以百分率表示。同时用MB-BAB-KDR、MB-B-KDR、MB-B分别与无DiI染色的HUVECs孵育作对照,光镜下计数成环率。 2.3平行板流动腔法检测MB-BAB-KDR的体外黏附稳定性 35mm培养皿甲醇漂洗后风干、备用。用PBS溶液分别配备1000ng/ml、600ng/ml、200ng/ml、100ng/ml、10ng/ml的小鼠KDR Fc溶液,用微量加样枪按200μl滴加在培养皿中央,置4℃冰箱过夜备用；次晨使用前用0.05%的吐温20冲洗6遍,3%的TBS-小牛血清白蛋白液封闭1h。将包被好的培养皿与平行板流动腔装置连接,在1.2dyn/cm2剪切应力下,浓度为5×106个/ml的MB-BAB-KDR经微量注射泵通过平行板流动腔,自显微镜下观察有微泡出现后开始连续录像6min。以10OOng/ml KDR Fc包被+大量抗小鼠KDR单抗封闭(封闭组)和Ong/ml KDR Fc包被(空白组)为对照。所有分组均检测3个样本。25帧/s的视频采集后,利用IPP (Image-Pro-Plus)图像分析软件的图像均化及自动跟踪功能,在细胞计数板的协助下测量不同浓度视野内于整分钟点结合的MB-BAB-KDR个数。 3MB-BAB-KDR与小鼠子宫血管内皮细胞的KDR体内靶向结合初步实验 3.1小鼠模型的制备 KM雌性小鼠(由南方医科大学实验动物中心提供)2只(8-10周龄,重约30g),1只异氟烷麻醉后解剖,将小鼠子宫暴露,对小鼠子宫位置及形态了解,另1只利用VEVO2100高频超声生物仪,40MHz高频探头对小鼠子宫行常规二维超声成像,为后期小鼠子宫分子成像提供解剖基础。另取KM小鼠18只(雌性15只,雄性3只,8-10周龄,重约30g),将健康成年雌雄小鼠按2：1于前一晚20：00合笼,自由饮食和饮水,室温25℃左右,次日晨检查阴栓形成情况。 根据雌性小鼠被检查到阴栓的时间进行分组,检查到有阴栓为受孕第一天定义为day-1(D1),其余妊娠天数类推,分别制备day-2(D2)组、day-4(D4)组小鼠,将没有合笼的雌性小鼠定义为day-0(DO)组。三个组的小鼠子宫为研究对象,每组各5只。 3.2MB-BAB-KDR与小鼠子宫血管内皮细胞的靶向结合实验 用异氟烷将不同子宫容受性的小鼠麻醉,经尾静脉随机注射MB-BAB-KDR或对照微泡(MB-B)后,用VEVO2100小、动物超声成像仪,40MHz高频探头,进行小鼠子宫成像。每只小鼠经尾静脉注射靶向微泡(MB-BAB-KDR)和普通微泡(MB-B)各5×107个,两种微泡注射顺序随机,两次造影之间间隔30min。于每次注射微泡4min后,先采集200帧图像,然后触发burst序列(transmit power,100%; mechanical index,0.63) ls,再采集200帧。用触发burst前后的图像进行减影,得到的信号即为粘附的靶向微泡的信号,将其用绿色伪彩标示。整个实验过程中保持动物及探头的位置固定不变。依据伪彩颜色的明显程度对靶向吸附微泡数进行半定量分析。以下目测标准对造影伪彩绿色强弱进行分级：0级：未见明显绿色,即减影前后,图像无明显差别,靶向微泡没有或较少吸附,无法显示；Ⅰ级：可见到绿色,但绿色较少,为星点状分布；Ⅱ级：绿色较为明显,且绿色范围较多,呈小片状分布,即减影前后差别较大,靶向吸附微泡数目较多。 3.3免疫荧光法检测小鼠子宫血管内皮细胞KDR的表达 分别取D0,D2,D4时期的小鼠子宫制作冰冻切片,用免疫荧光法分别对其KDR的表达情况进行检测。同时为了形象观察小鼠子宫血管内皮细胞上的KDR的表达,应用带有绿色荧光的CD31对小鼠子宫血管内皮细胞进行标示。荧光显微镜下观察小鼠子宫血管内皮细胞及其上的KDR的着色情况,依据以下目测标准对红色荧光标记的KDR进行分级：阴性：未见明显红色荧光,弱阳性：可见到红色荧光,但荧光微弱或暗淡,阳性：可见较明亮红色的荧光。带绿色荧光CD31标记的血管内皮细胞的分级为：阴性：未见明显绿色荧光；弱阳性：可见到绿色荧光,但荧光微弱或暗淡,规律性一般,未见明显管条状分布；阳性：可见较明亮绿色的荧光,且排列规律,呈管条状分布,即血管形成,血管内皮细胞排列规律。 4统计学方法 采用SPSS13.0软件包进行统计学分析,计量资料数据以均数±标准差(Mean±SD)表示。MB-B、MB-BAB-KDR及NMB-B-KDR三种微泡粒径之间的比较采用单向方差分析,计数资料成环率采用百分率表示,数据比较采用多个独立样本比较的非参数秩和检验；平行板流动腔实验稳定结合的靶泡数目之间采用一个重复测量两因素方差分析。免疫荧光法测得的MB-BAB-KDR上单抗的生物活性、MB-BAB-KDR在小鼠子宫的靶向超声分子显影采用半定量分析方法。检验水准以P0.05为差异具有统计学意义。结果 1MB-BAB-KDR的制备及性能测定 1.1三种微泡基本物理性能 MB-B、MB-BAB-KDR及NMB-B-KDR的悬浮液外观呈乳白色,在200倍光学显微镜下观察,微泡粒径分布均匀无聚集现象,单个微泡外观圆整,为透亮气泡。库尔特粒径分析仪测得MB-B的平均直径约(2.19±1.35)μm,浓度约9.8×108个/ml；MB-BAB-KDR平均直径为(2.42±1.71)μm,浓度约为9.6×108个/ml；MB-B-KDR平均直径为(2.38±1.60)u m,浓度约为9.6×108个/ml。三种微泡的外观、形态均未见明显差别,粒径大小差异无统计学意义。 1.2MB-BAB-KDR生物活性的测定 与荧光二抗孵育后,MB-BAB-KDR的荧光强度为Ⅱ级,MB-B-KDR荧光强度为Ⅰ级,MB-B荧光强度为0级。 2MB-BAB-KDR的体外特异性结合及黏附稳定性实验 2.1HUVECs KDR表达的测定 流式细胞仪测得HUVECs的FITC携带率达99%,即所使用的HUVECs的KDR为高表达状态。免疫荧光实验显示HUVECs的KDR呈强阳性表达,阳性物质定位于细胞膜及胞浆内。 2.2MB-BAB-KDR与HUVECs体外靶向特异结合情况 光镜下可见MB-BAB-KDR围绕在有或无DiI染色的HUVECs周围或黏附于其之上,形成花环样结构,有DiI染色的HUVECs花环形成率平均为89.97%,无DiI染色的HUVECs花环形成率平均为88.22%。荧光镜下被DiI染色的细胞发出明亮的红色荧光,黏附于细胞周围的被FITC标记的MB-BAB-KDR外壳发出明亮的绿色荧光,用Nikon成像系统里面的重叠软件重合图片,可清晰看到细胞周围靶向微泡吸附。MB-B-KDR组成环率为7.25%,MB-B组的成环率为3.33%,均显著低于MB-BAB-KDR组,P0.005。 2.3平行板流动腔实验检测MB-BAB-KDR的黏附稳定性实验 平行板流动腔实验显示在血流剪切应力为1.2dyn/cm2下,MB-BAB-KDR可与浓度为1000ng/ml、600ng/ml、200ng/ml、100ng/ml、10ng/ml的KDR Fc包被结合,所录视频经IPP软件处理,稳定黏附的MB-BAB-KDR与移动的MB-BAB-KDR将被区别。MB-BAB-KDR经过不同浓度KDR Fc包被的平行板流动腔,重复测量方差分析显示,观察6min内,MB-BAB-KDR结合数目随着平行板流动腔上KDR Fc包被浓度的提高而增加(F=571.926,P0.01)；在同一浓度下,随着时间的推移,MB-BAB-KDR结合数目也在增加。MB-BAB-KDR几乎不能与空白培养皿及被抗小鼠KDR单抗封闭掉位点的KDR Fc结合,在整个6min时间段内,结合总数仅为3-5个,且不同时间点结合在视野不同地方,即为随机结合且不能抵抗剪切力。 3MB-BAB-KDR与小鼠子宫血管内皮细胞的KDR体内靶向结合实验 雌雄小鼠合笼后,分别就不同时间(DO,D2,D4)进行AMB-BAB-KDR靶向超声造影。观察小鼠子宫超声靶向显影绿色伪彩区,DO期为0级,D2、D4期分别为Ⅰ级、Ⅱ级；病理实验证实,小鼠子宫血管内皮细胞的KDR的表达在D0、D2、D4期是阴性、弱阳性、阳性,而应用MB-B进行造影,小鼠子宫超声靶向显影绿色伪彩区在三组中均为0级。 结论 1本研究采用生物素-亲和素桥法成功构建了携KDR单抗的靶向脂质超声微泡MB-BAB-KDR。 2体外结合实验证实,制备的MB-BAB-KDR可与KDR高表达的HUVECs特异性结合形成花环样结构,并可与流动腔上的KDR Fc包被稳定结合,结合数目随着KDR Fc包被浓度及时间增加呈现增多趋势,表明制备的MB-BAB-KDR保留了与KDR特异性结合的生物活性及抵抗一定血流剪切力的能力,为体内靶向分子检测KDR奠定了实验基础。 3小鼠体内实验证实,制备的MB-BAB-KDR可与小鼠子宫血管内皮细胞的KDR结合,并且超声分子显影级别与KDR的表达水平一致,初步实现了子宫血管内皮细胞KDR表达的靶向超声分子检测,使基于KDR的子宫内膜容受性无创性评价成为可能。 4本课题的实施使临床上应用靶向超声造影技术无创评价子宫内膜容受性成为可能。另外该课题的实施对于与子宫内膜容受性相关的其他细胞因子的靶向分子显像有推广作用,为进一步超声介导载药或载基因微泡对改善子宫内膜容受性的靶向治疗及疗效评价提供了技术支持。
【关键词】：靶向超声造影剂 KDR 子宫内膜容受性 平行板流动腔
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R714.8;R816.91
【目录】：

• 摘要3-12
• ABSTRACT12-24
• 前言24-27
• 第一章 MB-BAB-KDR的制备及生物活性测定27-38
• 1 目的27
• 2 材料与方法27-30
• 3 结果30-32
• 4 讨论32-37
• 5 结论37-38
• 第二章 MB-BAB-KDR的体外特异性结合及黏附稳定性实验38-52
• 1 目的38
• 2 材料与方法38-43
• 3 结果43-48
• 4 讨论48-50
• 5 结论50-52
• 第三章 MB-BAB-KDR与小鼠子宫血管内皮细胞KDR的体内初步靶向结合实验52-63
• 1 目的52
• 2 材料与方法52-56
• 3 结果56-59
• 4 讨论59-62
• 5 结论62-63
• 全文总结63-64
• 不足之处及下一步要解决的问题64-65
• 参考文献65-69
• 综述69-76
• 参考文献73-76
• 缩略语中英文对照表76-77
• 成果77-78
• 课题资助基金78-79
• 致谢79-80

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前7条

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