低氧诱发自噬对喉癌Hep-2细胞放化疗敏感性的影响及Stat3对自噬调控作用

发布时间：2017-08-28 21:19

  本文关键词：低氧诱发自噬对喉癌Hep-2细胞放化疗敏感性的影响及Stat3对自噬调控作用

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【摘要】：目的：观察低氧微环境对喉癌Hep-2细胞增殖情况的影响及其对细胞自噬的作用，进一步研究细胞自噬对喉癌Hep-2细胞放化疗敏感性的影响，探究Stat3信号通路对细胞自噬的调控作用及可能机制，寻求肿瘤预防和治疗的新策略。 方法： 1体外常氧和低氧条件下培养喉癌Hep-2细胞，给予不同浓度顺铂(0μmol/L,10μmol/L,20μmol/L,40μmol/L,80μmol/L,160μmol/L），不同剂量放射线（0Gy,5Gy,10Gy,15Gy,20Gy）后继续培养24h, MTT方法检测细胞增殖情况。 2体外不同时间（3h,6h,9h,12h,24h）低氧培养喉癌Hep-2细胞，Western blot法检测蛋白Stat3, p-Stat3, HIF-1ɑ及自噬相关蛋白Beclin1和LC3的表达情况。给予Jak激酶抑制剂AG490(40mg/L)预处理1h继续低氧培养6h,12h,24h后，Western blot法检测蛋白Stat3, p-Stat3及自噬相关蛋白Beclin1和LC3的表达情况。 3体外经AG49040mg/L预处理1h，，3-MA (4mmol/L)预处理3h联合不同浓度顺铂（0μmol/L,10μmol/L,20μmol/L,40μmol/L,80μmol/L），不同剂量放射线（0Gy,5Gy,10Gy,15Gy）继续低氧培养24h，MTT方法检测细胞增殖情况。雷帕霉素(100nmol/L)预处理3h联合不同浓度顺铂化疗（0μmol/L,10μmol/L,20μmol/L,40μmol/L,80μmol/L），不同剂量放射线放疗（0Gy,5Gy,10Gy,15Gy）后继续常氧培养24h，MTT方法检测胞增殖情况。Western blot的方法检测分别经3-MA和雷帕霉素处理后自噬标志性蛋白LC3的表达情况。 结果：1不同浓度的顺铂、不同剂量的放射线干预喉癌Hep-2细胞后对细胞增殖具有抑制作用且具有浓度依赖性和剂量依赖性，不同浓度顺铂化疗组：低氧F=192.110，P=0.000＜0.01，常氧F=123.146，P=0.000＜0.01；不同剂量放射线放疗组：低氧F=103.438，P=0.000＜0.05,常氧F=264.641，P=0.000＜0.01；差异具有统计学意义（方差分析的统计学方法）。常氧组与低氧组相比,不同浓度顺铂化疗和不同剂量放射线放疗，低氧组细胞的增殖抑制作用明显下降，P0.01（独立样本T检验的统计学方法），差异具有统计学意义。 2不同处理方式后蛋白Stat3, p-Stat3, HIF-1ɑ及自噬相关蛋白Beclin1和LC3的表达变化情况。 2.1不同低氧时间（0h,3h,6h,9h,12h,24h）培养Hep-2细胞Western blot法检测蛋白Stat3, p-Stat3, HIF-1ɑ及自噬相关蛋白Beclin1和LC3的表达情况，方差分析的统计学方法进行分析。与常氧条件下相比较Stat3蛋白在低氧条件下无明显变化，P0.05,差异无统计学意义;蛋白p-Stat3及自噬相关蛋白Beclin1和LC3蛋白的变化于低氧6h后逐渐升高，24h达到较高水平，低氧培养6h,9h,12h,24h与常氧比较蛋白表达明显升高，P0.05,差异具有统计学意义；HIF-1ɑ蛋白的表达情况于低氧9h开始逐渐升高，24h达到高峰，P0.05，差异具有统计学意义。 2.2体外低氧培养Hep-2细胞，给予AG490预处理1h后继续低氧培养6h,12h,24h，不同时间点AG490组与未加AG490组比较，Stat3蛋白表达无明显变化，P0.05,差异无统计学意义；蛋白p-Stat3, Beclin1和LC3表达明显下降，6h,12h,24h, P0.01,差异具有显著统计学意义(独立样本T检验的统计学分析方法)。 2.33-MA (4mmol/L)、雷帕霉素（100nmol/L）预处理3h继续分别低氧和常氧条件下培养24h,常氧组（24N）和常氧加雷帕霉素组（24N+RAPA）比较，24N+RAPA组LC3蛋白表达情况明显高于24N组, t=11.162, P=0.000＜0.01,差异具有统计学意义；低氧组（24H）与低氧加3-MA组（24H+3-MA）比较，24H+3-MA组LC3蛋白表达情况明显低于24H组，t=13.074, P=0.000＜0.01,差异同样具有显著差统计学意义（独立样本T检验的统计学方法）。 3MTT检测不同浓度顺铂、不同剂量放射线与AG490,3-MA及雷帕霉素联合应用后对细胞增殖的影响，独立样本T检验的统计学方法进行数据分析。 3.1体外经AG49040mg/L预处理1h，3-MA (4mmol/L)预处理3h后联合不同浓度顺铂化疗、不同剂量放射线放疗继续低氧条件下培养24h后，MTT检测细胞增殖情况，AG490，3-MA组与仅放化疗组相比，细胞增殖抑制明显增加，当顺铂浓度为10μmol/L，3-MA组与单纯化疗组相比P0.05，其他AG490，3-MA组与仅放化疗组相比P0.01，差异具有统计学意义。 3.2体外雷帕霉素(100nmol/L)预处理3h后联合不同浓度顺铂化疗，不同放射剂量放疗后继续常氧培养24h后，雷帕霉素组细胞增殖抑制较仅放化组明显提高，差异有统计学意义(联合应用雷帕霉素组与单纯放射线放疗相比，仅10Gy,15Gy时P0.05,其他各组P0.01)。 结论： 1不同浓度顺铂化疗和不同剂量放射线放疗在低氧和常氧条件下均对Hep-2细胞增殖具有抑制作用，且低氧可以增加肿瘤细胞对放化疗的抵抗。 2低氧可以促进Hep-2细胞Stat3的磷酸化，诱导HIF-1ɑ的表达，而对总Stat3没有影响；低氧可以促进自噬相关蛋白Beclin1和LC3的表达，诱发细胞自噬。抑制Stat3的磷酸化可以抑制自噬相关蛋白Beclin1和LC3的表达，从而抑制自噬过程，增加肿瘤细胞低氧放化疗敏感性。 33-MA可以抑制喉癌Hep-2细胞低氧诱发的自噬，减少自噬相关蛋白LC3的表达,增强肿瘤细胞低氧放化疗敏感性；雷帕霉素可以诱发Hep-2细胞自噬，增加自噬相关蛋白LC3的表达，增强常氧条件肿瘤细胞的放化疗敏感性。
【关键词】：低氧 自噬 喉肿瘤 放疗敏感性 化疗敏感性 增敏作用 Stat3信号通路
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R739.65;R730.55
【目录】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-11
• 英文缩写11-12
• 前言12-13
• 材料与方法13-23
• 结果23-27
• 附图27-32
• 附表32-36
• 讨论36-40
• 结论40
• 参考文献40-44
• 综述 自噬与低氧微环境下肿瘤细胞放化疗敏感性关系的研究进展44-55
• 参考文献50-55
• 致谢55-56
• 个人简历56

【参考文献】

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1 刘春玲;李晓明;路秀英;张立坤;;HIF-1α反义寡核苷酸对喉鳞状细胞癌hep-2细胞放疗的增效作用[J];临床耳鼻咽喉头颈外科杂志;2007年13期

本文编号：749541