抗精子适体的制备及其在精子富集上的研究

发布时间：2017-08-31 13:27

  本文关键词：抗精子适体的制备及其在精子富集上的研究

  更多相关文章： 核酸适体 精子细胞检测 链霉素磁珠 单链 DNA 磁分离 短串联重复序列

【摘要】：探索精子细胞的高敏感高特异性新检测方法对于实现法医学中精斑的确认与个体识别具有极其重要的意义。传统的精斑、精子检测方法主要有通过镜检观察精子的细胞形态,抗原抗体反应或者检测精斑中特殊含量的酶等。确定精斑后,可通过差异裂解等方法分离出精子DNA,再进行精子DNA扩增与后续DNA分型。这些方法往往因为杂质(包括女性阴道上皮细胞DNA)的干挠而存在敏感性低,甚至假阳性等局限性。核酸适体(aptamer)因其亲和力高、特异性强、合成经济、易保存,可通过荧光基团等修饰使其与靶标的结合成为可视性等优点,被用作为一类新型分子探针,即可用来作为识别探针,也可用来构建捕捉工具,广泛地应用于细胞的检测和富集中。本课题体外合成长度为84个碱基(包含已知序列的上、下游引物各22个碱基)的随机单链作为初级文库,通过全细胞改良指数富集的配基系统进化(cell-SELEX)技术筛选出7条与精子细胞特异性结合的单链DNA适体,利用Clustal2.05、mfold软件对DNA适体序列进行一级结构同源性分析和二级结构预测,然后采用荧光标记法检测单链DNA适体与精子细胞的特异性结合,挑选出与精子细胞特异性结合的A-3适体进行精子细胞富集实验。精子细胞富集实验中将生物素修饰的A-3适体固定在链霉素磁珠上,通过生物素-链霉亲和素的作用,制备了能特异性捕获、富集精子细胞的A-3适体功能化磁珠。该A-3适体功能化磁珠捕获精子细胞后,在简单的磁场力下即可对精子细胞进行富集。在精子细胞数量超过10000时,捕获效率稳定在60%以上,A-3适体功能化磁珠对精子细胞的最低检测线为100个数量级。当细胞混合液中10000/m L的精子细胞和10000/m L上皮细胞时,A-3适体功能化磁珠可以将其中64.26%的精子细胞分离出来,分离纯度超过了96%。我们采用特异性A-3适体结合磁珠建立了精子分离技术,并进一步建立以富集为特征的精子细胞检测新方法。该方法既可以用来在光学显微镜下直接检验精子细胞,也可以用来提高其他检测手段(例如下游的PCR法)的敏感性。本课题通过法医学上的实际应用,进一步验证了磁珠富集分离法的实用性。由性犯罪现场取证回来的9份精斑痕迹标本,按常规方法制备提取液。A-3适体功能化磁珠因生物素标记的A-3适体能特异捕获精斑提取液中的精子,在简单的磁场力作用下便能通过生物素-连霉亲和素作用力实现精子细胞的富集。将富集得到的精子细胞进行STR(短串联重复序列)基因座的单一男性分型。传统的差异裂解法作为对照。初步实验结果表明,差异裂解法成功得到三份精斑STR基因座的单一男性分型,磁珠分离法得到两份。其中有一份标本同时成功地被差异裂解法和磁珠分离法阳性检出,检测结果彼此一致;另有一份标本未能被差异裂解法检出,但用磁珠分离法成功地检出分型,其结果与嫌疑犯的血液标本检测结果一致。本研究通过改良的cell-SELEX方法筛选了7条抗人精子aptamer,通过荧光显微镜对混合细胞的检测证实了aptamer结合精子的特异性。其中A-3 aptamer用来进一步研究,建立了基于aptamer的精子分离法,进一步用来检测精斑。实验所用试剂和仪器简单,所用时间较传统方法大大减少,有望成为当前法医常规精斑检测法的一种互补方法,提高精子检测准确率。
【关键词】：核酸适体 精子细胞检测 链霉素磁珠 单链 DNA 磁分离 短串联重复序列
【学位授予单位】：华侨大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：D919
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 主要符号对照表10-11
• 第1章 引言11-25
• 1.1 抗精子适体课题来源11-12
• 1.2 精斑检测的重要性12
• 1.3 精子细胞富集的重要性12-13
• 1.4 精斑检测方法的进展13-15
• 1.5 现阶段精斑确定与精子分离技术的研究15-17
• 1.6 精子细胞检测中的识别探针17-18
• 1.6.1 基于抗原-抗体反应的识别探针17
• 1.6.2 基于受体配体作用的识别探针17-18
• 1.7 核酸适体探针18-19
• 1.8 适体和抗体的比较19-20
• 1.9 磁珠分选法20-21
• 1.10 STR基因座21-23
• 1.11 课题介绍23-25
• 第2章 抗精子细胞的寡核苷酸适体的筛选和鉴定25-50
• 2.1 前言25
• 2.2 实验部分25-40
• 2.2.1 试剂和仪器26-29
• 2.2.2 cell-SELEX试验总流程图29
• 2.2.3 文库的制备与引物的合成29-30
• 2.2.4 精子细胞的处理30
• 2.2.5 精子细胞适体筛选30-37
• 2.2.6 TOPO TA克隆适体特异性分析37-40
• 2.3 实验结果及讨论40-47
• 2.3.1 PCR条件优化结果40-41
• 2.3.2 不同筛选轮数的PCR产物琼脂糖电泳结果41
• 2.3.3 荧光基团 6-FAM和Alexa Fluor 488对PCR产物影响的比较41-42
• 2.3.4 TOPO TA克隆42-44
• 2.3.5 适体一级结构同源性分析44
• 2.3.6 适体二级结构预测44-46
• 2.3.7 荧光显微镜检测候选适体与精子细胞的特异性46-47
• 2.4 讨论47-50
• 第3章 基于核酸适体靶向识别功能的精子细胞磁分离和富集研究50-61
• 3.1 前言50-51
• 3.2 实验部分51-54
• 3.2.1 试剂和仪器51-52
• 3.2.2 核酸适体功能化磁珠的制备52-53
• 3.2.3 核酸适体在磁珠表面的修饰率表征53
• 3.2.4 精子细胞的染色53
• 3.2.5 A-3 适体功能化磁珠对精子细胞的特异性捕获与富集53
• 3.2.6 核酸适体功能化磁珠对混合体系中精子细胞的特异性捕获与富集53-54
• 3.3 实验结果54-59
• 3.3.1 实验原理54-55
• 3.3.2 核酸适体在磁珠表面的修饰效率表征55
• 3.3.3 核酸适体A-3 的特异性分析55-56
• 3.3.4 核酸适体功能化磁珠对精子细胞的特异性捕获与富集56-58
• 3.3.5 核酸适体功能化磁珠对混合体系中精子细胞的特异性捕获与富集58-59
• 3.4 讨论59-61
• 第4章 精子细胞DNA的STR分型61-68
• 4.1 前言61
• 4.2 实验部分61-64
• 4.2.1 试剂和仪器61-63
• 4.2.2 检材处理63
• 4.2.3 精子细胞的磁珠结合与分离63
• 4.2.4 多位点STR复合扩增63-64
• 4.2.5 DNA样品电泳64
• 4.2.6 结果分析64
• 4.3 结果64-66
• 4.3.1 磁珠富集法分离精子细胞DNA分型检测情况64-66
• 4.4 讨论66-68
• 第5章 结论与展望68-70
• 参考文献70-75
• 致谢75-76
• 个人简历、在学期间发表的学术论文和研究成果76

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 李鑫;胡兰;郭红玲;刘志芳;Q谜，

本文编号：765855