实时荧光定量PCR检测内、外源IGF-Ⅰ表达的实验研究

发布时间：2017-09-03 19:29

  本文关键词：实时荧光定量PCR检测内、外源IGF-Ⅰ表达的实验研究

  更多相关文章： 基因兴奋剂 胰岛素样生长因子-Ⅰ 腺相关病毒 检测

【摘要】：研究目的:兴奋剂问题一直以来都是困扰所有体育赛事的主要问题之一,世界反兴奋剂机构禁止在一切运动赛事中使用兴奋剂。然而对于兴奋剂的有效检测却远远落后于兴奋剂的研发与使用。本实验通过研究基因兴奋剂IGF-Ⅰ,建立一种检测区分内、外源基因表达的方法,为基因兴奋剂的有效检测提供理论依据。研究方法:本实验采用r AAV2介导IGF-Ⅰ的方法将外源基因注射进入小鼠肌肉,用以检测区分内、外源基因的表达情况。研究对象为30只雄性ICR小鼠,随机分为空白对照组(n=6)、注射3d组(n=6)、注射7d组(n=6)、注射14d组(n=6)、注射30d组(n=6)。构建含有目的基因IGF-Ⅰ的质粒,并进行病毒包装。在小鼠右侧后肢膝关节上方斜行进针进行病毒注射,每组按照不同的实验天数分别提取肌肉和血液中的DNA。通过在IGF-Ⅰ基因序列外显子2,3之间设计特异性的荧光探针来识别外源性IGF-Ⅰ基因,合成ITC基因以及相应的ITC探针,作为实验内部阈值调控的模版。以肌肉和血液提取得到的样本DNA为模板进行实时荧光定量PCR,实验过程中样本DNA、ITC质粒、IGF-Ⅰ目的探针、ITC探针、引物等放在同一体系中反应。实验结束后通过比较IGF-Ⅰ目的探针与ITC探针Ct值的大小,来排除实验过程中外界因素的干扰。通过比较相应组别的Ct值,来确定IGF-Ⅰ的表达。实验结果采用Excel与SPSS17.0统计软件进行分析。研究结果:(1)在实时荧光定量PCR过程中,通过实验仪器能够捕捉到目的探针荧光信号的积累,说明实验过程中注射的外源性IGF-Ⅰ在小鼠体内得到表达,本实验设计的方法,能够检测到外源基因的表达。(2)不同时间获取肌肉,提取DNA进行PCR,实验结果显示随着实验天数的增多Ct值逐渐增大,且3d组与7d组之间Ct值升高明显,14d组与30d组之间Ct值升高趋于缓慢;不同时间获取血液,提取DNA进行PCR,实验结果显示随着实验天数的增多Ct值变化的趋势不明显,但二者Ct值均小于空白对照组Ct值。(3)分别以肌肉和血液提取DNA为模版进行PCR,在3d,7d组,肌肉DNA的Ct值小于血液DNA的Ct值,两者之间差异显著(P0.01)。14d,30d组,肌肉DNA的Ct值大于血液DNA的Ct值,且两者之间差异显著(P0.01)。(4)以不同取材量肌肉、血液提取DNA为模版进行PCR,实验结果显示,不同取材量PCR后的Ct值两者之间没有显著性的差异(P0.05)。研究结论:(1)本实验建立的方法能有效的检测区分内、外源IGF-Ⅰ的表达。(2)不同取材时间对肌肉的检测结果有显著影响,对血液的检测结果没有影响。(3)不同取材组织对检测结果有较大影响。本实验结束显示,基因注射后7天内肌肉检测比血液检测更稳妥,注射7天后血液检测比肌肉检测更有利。(4)不同取材量对实验检测的结果没有影响。
【关键词】：基因兴奋剂 胰岛素样生长因子-Ⅰ 腺相关病毒 检测
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R440;R87
【目录】：

• 中文摘要4-6
• abstract6-10
• 序言10-12
• 1 文献综述12-25
• 1.1 兴奋剂及兴奋剂的检测12-21
• 1.1.1 现代奥运会的发展及兴奋剂问题的出现12-13
• 1.1.2 兴奋剂问题13-16
• 1.1.3 基因兴奋剂16-20
• 1.1.4 兴奋剂的检测20-21
• 1.2 胰岛素样生长因子（IGF）概述21-23
• 1.2.1 IGF-Ⅰ21-22
• 1.2.2 IGF-Ⅰ的生理作用22-23
• 1.2.3 基因兴奋剂IGF-Ⅰ23
• 1.3 实时荧光定量PCR技术23-24
• 1.4 总结24-25
• 2 材料与方法25-37
• 2.1 实验动物及分组25
• 2.2 携带人IGF-Ⅰ基因pTR-IGF-Ⅰ-GFP质粒的构建25-28
• 2.3 rAAV2-IGF-Ⅰ重组腺相关病毒的包装、纯化及滴度测定28-32
• 2.3.1 rAAV2-IGF-Ⅰ重组腺相关病毒的包装28-29
• 2.3.2 rAAV2-IGF-Ⅰ重组腺相关病毒的纯化29
• 2.3.3 rAAV2-IGF-Ⅰ重组腺相关病毒蛋白外壳的鉴定29-30
• 2.3.4 Western-blot检测rAAV介导的IGF-Ⅰ表达30
• 2.3.5 rAAV2-IGF-Ⅰ重组腺相关病毒滴度的测定30-32
• 2.4 rAAV2-IGF-Ⅰ重组腺相关病毒肌肉注射32
• 2.5 实验动物的取材及测试指标32
• 2.5.1 血液相关指标的取材32
• 2.5.2 肌肉相关指标的取材32
• 2.6 ITC模版的建立：引物-探针的设计32-34
• 2.7 Real time PCR（探针法）体系及条件34-35
• 2.7.1 Real time PCR仪器检测限度测定34
• 2.7.2 样品DNA检测体系及反应条件34-35
• 2.8 实验所需主要仪器及试剂35-36
• 2.8.1 实验主要仪器35-36
• 2.8.2 实验主要试剂36
• 2.9 数据统计处理36-37
• 3 实验结果37-43
• 3.1 pTR-IGF-Ⅰ-GFP质粒构建鉴定结果37
• 3.2 rAAV2-IGF-Ⅰ重组腺相关病毒包装及鉴定结果37-38
• 3.3 rAAV2-IGF-Ⅰ重组腺相关病毒滴度测定结果38-39
• 3.4 Real time PCR仪检测精度测定结果39-40
• 3.5 实验结果特异性、可信性及重复性检测结果40-41
• 3.6 不同取材时间、不同取材组织Real time PCR实验结果41-42
• 3.7 不同取材量Real time PCR实验结果42-43
• 4 分析与讨论43-49
• 4.1 腺相关病毒（AAV）作为基因导入体内载体的可行性43-45
• 4.2 实验结果的特异性、可信性及重复性45-46
• 4.3 不同取材时间、不同取材组织对实验检测结果的影响46-47
• 4.4 不同取材量对试验检测结果的影响47-48
• 4.5 本实验的创新点及实验不足之处48-49
• 5 结论49-50
• 6 参考文献50-56
• 7 攻读硕士学位期间公开发表论文56-57
• 8 附录57-58
• 9 致谢58-59

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前6条

1 陈旭;齐凤坤;康立功;李景富;;实时荧光定量PCR技术研究进展及其应用[J];东北农业大学学报;2010年08期

2 杨晨利，董翠香;竞技运动与兴奋剂[J];河南师范大学学报(自然科学版);1995年04期

3 曹佐武;林羿;程龙球;邹飞雁;;ITR缺陷对AAV病毒包装与感染力的影响[J];生物化学与生物物理进展;2008年02期

4 郑斌;奥运会兴奋剂检查发展趋势[J];体育科技文献通报;2005年09期

5 薛慧良;;胰岛素样生长因子系统的研究进展[J];生物学教学;2007年11期

6 曾凡星;回顾与反思:兴奋剂的使用与禁用[J];天津体育学院学报;2002年01期

，

本文编号：786937