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3-甲基腺嘌呤及SIK2对放射诱发细胞自噬的影响研究

发布时间:2017-09-19 01:13

  本文关键词:3-甲基腺嘌呤及SIK2对放射诱发细胞自噬的影响研究


  更多相关文章: 盐诱导激酶2(SIK2) 3-MA 电离辐射 细胞凋亡 细胞自噬 放射敏感性 分割剂量照射


【摘要】:目的:研究PI3K抑制剂3-MA、SIK2以及分割照射对细胞增殖、细胞凋亡以及细胞自噬的影响,探索SIK2在电离辐射诱发细胞自噬中的作用。探讨3-MA在细胞照射后对细胞自噬及凋亡发生的影响,并观察照射的生物效应时效规律,为阐明电离辐射诱发细胞自噬的机制提供新的依据。方法:1.4 Gy 60Coγ、3-MA早期作用(即在照射后即刻时间点加入3-MA并作用12 h)和3-MA后期作用(即在照射后12 h加入3-MA并作用12 h)于sh RNA介导SIK2敲低的Hela-sh SIK2及其对照细胞后,于0 h,12 h,24 h,48 h和72 h用CCK8检测不同处理后细胞的增殖和毒性效应。2.4 Gy 60Coγ、3-MA早期作用和3-MA后期作用于Hela-sh SIK2及其对照细胞,Annexin V-FITC/PI标记流式细胞术检测细胞凋亡。3.2 Gy、4 h分割照射剂量(2+2 Gy)和单剂量4 Gy X射线照射以及3-MA早期作用于Hela-sh SIK2及其对照细胞,克隆形成率检测细胞的放射敏感性。4.2 Gy、4 h分割照射剂量(2+2 Gy)和单剂量4 Gy X射线照射后,免疫印迹检测LC3蛋白随照射后时间表达水平的变化。5.2 Gy、4 h分割照射剂量(2+2 Gy)和单剂量4 Gy X射线照射转染GFP-LC3质粒的Hela-sh SIK2及其对照细胞,免疫荧光观察自噬体的形成。结果:1.CCK8结果显示各处理组和对照组相比,在12 h内3-MA晚期作用组无明显影响,其余处理组在12 h时即发现明显的细胞毒性,P0.05;以4 Gy照射组为对照组,照射联合3-MA早期(照射后即刻至12 h)处理组在12 h,24 h,48 h,72 h产生更大的毒性,差异具有统计学意义,P0.01;以4 Gy照射组为对照组,照射联合3-MA后期(照射后12 h至24 h)处理组在24 h、48 h和72 h产生更大的毒性,差异具有统计学意义,P0.01。2.流式细胞术测凋亡发现以0 h为对照组,各处理组的凋亡率增加具有统计学意义,P0.01;以4 Gy照射组为对照,照射联合3-MA早期作用组的差异具有统计学意义,P0.05。以照射联合3-MA早期作用组为对照,3-MA后期作用组差异具有统计学意义,P0.05。3.克隆形成率实验发现3-MA联合2+2 Gy照射组与3-MA联合4 Gy照射组相比较,细胞存活率高,差别具有统计学意义,P0.05;各剂量组加入3-MA前期作用后存活率明显降低,差别具有统计学意义,P0.01。Hela-sh SIK2细胞3-MA联合照射组与对照组Hela-sh NC细胞对放射更加敏感,细胞存活率差异具有统计学意义,P0.05。4.Western Blot结果表明,在对照细胞中三种剂量下都能引起LC3II的增多,并在24 h达到高峰。不同剂量同一时间LC3II表达情况,分割照射2+2 Gy LC3II的表达水平比单次4 Gy照射高,说明分割照射似乎增强了辐射诱导的细胞自噬;而在敲低细胞中,LC3II的表达水平比对照细胞低,说明SIK2敲低细胞减弱了细胞自噬。5.免疫荧光可看出SIK2敲低的细胞自噬标记蛋白LC3的荧光强度不及对照组。更有效的证实了SIK2对电离辐射后细胞自吞噬的负调控。且分割照射剂量2+2 Gy的荧光强度比其他照射组同一时间的荧光强度强。结论:3-MA早期作用和3-MA晚期作用对细胞毒性存在差异,3-MA早期作用对细胞毒性更大。3-MA早期作用比3-MA晚期作用更能促进凋亡,差异有显著性。分割照射剂量比单剂量照射下LC3Ⅱ的表达更多,更有利于自噬的发生。SIK2敲低后减弱了辐射诱发的细胞自吞噬作用,细胞的放射敏感性增加。
【关键词】:盐诱导激酶2(SIK2) 3-MA 电离辐射 细胞凋亡 细胞自噬 放射敏感性 分割剂量照射
【学位授予单位】:南华大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:R818
【目录】:
  • 摘要4-6
  • Abstract6-10
  • 主要英文缩略语索引10-11
  • 第1章 绪论11-15
  • 第2章 材料与方法15-31
  • 2.1 材料15-17
  • 2.2 方法17-31
  • 第3章 结果31-39
  • 3.1 SIK2对细胞生长的影响31
  • 3.2 γ 放射照射后不同时间3甲基腺嘌呤对He La细胞放射敏感性的影响31-33
  • 3.3 3-MA不同时间作用对受照射细胞凋亡的促进程度33-35
  • 3.4 分割照射剂量下细胞的放射敏感性35-36
  • 3.5 检测分割照射下SIK2敲低细胞自噬蛋白的表达36-37
  • 3.6 免疫荧光检测分割照射剂量下自噬体的形成37-39
  • 第4章 讨论39-43
  • 第5章 结论43-45
  • 参考文献45-49
  • 综述49-63
  • 参考文献57-63
  • 作者攻读学位期间的科研成果63-65
  • 致谢65

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