受照角质细胞HaCat产生电离辐射旁效应信号机制的研究

发布时间：2017-09-19 06:12

  本文关键词：受照角质细胞HaCat产生电离辐射旁效应信号机制的研究

  更多相关文章： 电离辐射旁效应 成纤维细胞 角质细胞 α粒子 TGF-β1/Smad2信号通路 mi R-21 MN

【摘要】：目的:电离辐射诱导的旁效应被定义为受照射细胞传递信号给周围未受照射的细胞从而导致后者出现的生物学变化。尽管旁效应的概念已被广泛接受,并且被认为可能在辐射致癌和放疗的疗效及副作用等方面发挥重要作用,但其发生的具体分子机制仍不明确。旁效应的产生需要两个细胞群,即受照细胞和未受照旁效应细胞。本课题的主要目的是从受照细胞的角度出发,来研究旁效应发生的分子机制并在构建的体系中探究旁效应的后果。首先在Ha Cat角质细胞中观察X射线是否能在同种细胞内诱导经培养液介导的旁效应,并对其可能机制做初步研究,在此工作的基础上,在以角质细胞Ha Cat和成纤维细胞WS1构建的二维培养模型中观察X射线和α粒子能否诱导旁效应的产生,研究旁效应的发生是否与射线品质相关,并进一步研究其相关机制,然后,对旁效应产生的后果进行研究,以细胞迁移能力为指标观察受照射角质细胞对未受照射角质细胞和成纤维细胞迁移能力的影响,最后,完成皮肤三维培养模型的初步构建,以期下一步在更接近机体正常环境的体系中研究旁效应。方法:首先采用条件培养液转移及二维共培养的方法,以微核(MN)、53BP1 foci、细胞增殖能力为生物学终点,检测X射线在角质细胞Ha Cat同种细胞中诱导经培养液介导的旁效应。用ELASA试剂盒检测条件培养液中TGF-β1的含量,用ROS试剂盒检测受到条件培养液培养后的未受照射角质细胞内ROS水平。然后采用二维共培养的方法,以MN形成为指标,观察角质细胞Ha Cat在分别经X射线、α粒子照射后能否在未受照射的成纤维细胞WS1中诱导旁效应的产生,探究该体系中旁效应的发生是否与射线品质有关。用TGF-β1受体激酶抑制剂SB431542抑制角质细胞Ha Cat内TGF-β1信号通路后,观察α粒子诱导的旁效应是否改变。用PCR检测受照射Ha Cat细胞内mi R-21的水平,然后观察经转染而过表达mi R-21水平的细胞受α粒子照射后诱导的旁效应MN是否发生变化,观察降低表达mi R-21水平的细胞是否能在与之共培养的WS1细胞中诱导类似旁效应MN的产生。用Western Blot检测经X射线或α粒子照射后的角质细胞Ha Cat内TGF-β1/Smad2信号通路激活情况,观察加入SB431542或者过表达该细胞mi R-21水平后是否降低α粒子诱导的Smad2的磷酸化水平,观察降低mi R-21表达水平后该通路的激活情况。用PCR检测经SB431542预处理再经α粒子照射后的Ha Cat细胞内mi R-21水平。观察经α粒子或X射线照射后的Ha Cat细胞内ROS的含量。采用同种细胞及异种细胞构建二维培养模型的方法,通过划痕实验观察受α粒子照射后的Ha Cat细胞分别对未受照射角质细胞及成纤维细胞的细胞迁移能力的影响。最后,以鼠尾胶原蛋白为基质,用角质细胞和成纤维细胞构建三维皮肤组织培养模型。结果:1、相对于相应对照组,经3 h条件培养液培养24 h及48 h后未受照射Ha Cat细胞MN形成率分别增加了28%和58%;经该条件培养液培养1 h后,未受照射Ha Cat细胞53BP1 foci阳性细胞率增加了44%;经该条件培养液培养24 h、48 h和72 h后,未受照射Ha Cat细胞的细胞增殖能力无明显变化。相对于新鲜培养液而言,3 h条件培养液中TGF-β1含量无明显变化。相对于新鲜培养液组,经3 h条件培养液培养1 h后,未受照射Ha Cat细胞内ROS水平增加了33%;但相对于相应对照组,经3 h条件培养液培养1 h后,未受照射Ha Cat细胞内ROS水平无明显变化。与受照细胞共培养48 h,未受照射Ha Cat细胞微核形成率增加了54%;与受照细胞共培养1 h,未受照射Ha Cat细胞53BP1 foci阳性细胞率增加了35%。2、I.在以角质细胞和成纤维细胞构建的二维培养模型中,以MN为指标,与对照组相比,发现未受照射的WS1细胞在与受到α粒子(0.56 Gy)照射的Ha Cat细胞共培养24 h后MN形成率增加了53%,而X射线(1、2、5、10 Gy)均不能诱导该现象的发生。但这种现象并非因为X射线造成的损伤小,事实上,2-10 Gy的X射线在Ha Cat细胞中造成的MN形成率和细胞致死率都高于0.56 Gy的α粒子。II.在该模型中,在照前用SB431542预处理Ha Cat细胞使得α粒子诱导的旁效应微核降至本底水平。III.α粒子(0.56 Gy)照射后Ha Cat细胞内Smad2磷酸化水平立即增高,于1 h达到高峰,并一直持续至少两个小时,而经X(1 Gy)射线照射后0 h、0.5 h、1 h、2 h Smad2磷酸化水平均无变化,加大X射线剂量至2、5、10 Gy同样不会增加Smad2磷酸化水平。IV.用10μM SB431542预处理Ha Cat细胞1 h,再用α粒子(0.56 Gy)照射,发现照射后1 h Smad2磷酸化水平在原有增加的基础上明显降低了。V.PCR结果显示信号细胞Ha Cat经α粒子(0.56 Gy)照射后1 h,mi R-21水平下降了1.6倍,3 h后mi R-21水平下降了1.2倍;经X射线(1 Gy)照射后1 h,mi R-21水平下降了1.4倍,3 h后却升高了1.7倍。在此结果基础上,过表达信号细胞中mi R-21使得α粒子诱导的旁效应MN降至本底水平,而仅仅降低信号细胞中mi R-21的表达就可以在与之共培养的WS1细胞中诱导类似旁效应的MN的产生。VI.信号细胞Ha Cat用10μM SB431542预处理1 h,再经0.56 Gyα粒子照射,照后1 h组mi R-21的下降水平由原来的1.6倍变为1.2倍,而3 h组则由原来的下降转为升高。VII.过表达Ha Cat信号细胞的mi R-21水平,再用0.56 Gyα粒子照射后,与相应对照组相比其Smad2的磷酸化水平降低。而当先降低Ha Cat信号细胞的mi R-21表达水平,发现与对照组相比,即使不加照射,也会激活TGF-β1/Smad2信号通路。VIII.α粒子(0.56 Gy)照射后5 h使得信号细胞内ROS水平增加了25%,X射线(1 Gy)照射使得细胞内ROS水平仅仅增加了3%。3、未受照射Ha Cat细胞在与受到α粒子(0.56 Gy)照射的Ha Cat细胞共培养24 h、48 h及72 h后细胞迁移能力明显增加,未受照射WS1细胞在与受到α粒子(0.56 Gy)照射的Ha Cat细胞共培养24 h、48 h及72 h后胞迁移能力明显减慢。4、成功完成了三维皮肤组织模型的构建。结论:1、X射线可以在角质细胞同种细胞间诱导旁效应的产生。2、在以角质细胞和成纤维细胞构建的二维培养模型中发现α粒子照射后可以诱导旁效应的产生,而X射线不能诱导旁效应的产生,显示旁效应的产生与射线品质相关。3、在异种细胞二维培养模型中,α粒子诱导的旁效应与受照Ha Cat细胞中TGF-β1/Smad2信号通路的激活和mi R-21的持续降低有关,并且TGF-β1/Smad2信号通路和mi R-21之间存在互相调控的作用。4、直接受照射角质细胞可以加快未受照射角质细胞的迁移速度,减慢未受受照射成纤维细胞的迁移速度。
【关键词】：电离辐射旁效应 成纤维细胞 角质细胞 α粒子 TGF-β1/Smad2信号通路 mi R-21 MN
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R818
【目录】：

• 中文摘要4-8
• Abstract8-14
• 引言14-18
• 第一章X射线在HaCat细胞中诱导旁效应现象的研究18-31
• 1 材料和仪器18-20
• 2 实验方法20-24
• 3 实验结果24-29
• 4 讨论29-31
• 第二章 旁效应与射线品质相关性的研究31-40
• 1 材料和仪器31-33
• 2 实验方法33-36
• 3 实验结果36-39
• 4 讨论39-40
• 第三章 旁效应与射线品质相关性机制的研究40-60
• 1 材料和仪器41-42
• 2 实验方法42-45
• 3 实验结果45-55
• 4 讨论55-60
• 第四章 旁效应现象后果的研究60-65
• 1 材料和仪器60-61
• 2 实验方法61-62
• 3 实验结果62-64
• 4 讨论64-65
• 第五章 三维皮肤培养模型的构建65-71
• 1 材料和仪器65-66
• 2 实验方法66-69
• 3 实验结果69-70
• 4 讨论70-71
• 结论与展望71-73
• 参考文献73-81
• 综述81-88
• 参考文献85-88
• 攻读学位期间本人出版或公开发表的论文88-89
• 参与的科研项目89-90
• 缩略词表90-91
• 致谢91-92

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 徐瑞霞;陈曦;陈静海;韩瑜;韩变梅;;大鼠骨髓间充质干细胞条件培养液促进心肌细胞肥大[J];细胞生物学杂志;2007年04期

2 曹菊荣,薛惠华,吴祖泽,王玉芝;人脐带条件培养液的制备与集落刺激活性[J];军事医学科学院院刊;1987年06期

3 汪声恒,黄友章;胎肌条件培养液生物效应的研究[J];中国应用生理学杂志;1993年04期

4 黄友章,汪声恒,李培峰,刘福陆;胎肌条件培养液中有效成份的研究[J];白血病;1997年01期

5 汪声恒，黄友章;胎肌条件培养液对粒细胞活性的效应[J];山西白血病;1994年03期

6 李爱玲,李宏伟,王程,张静,修瑞娟;肿瘤条件培养液对人脐静脉内皮细胞生长、增殖的影响[J];中国微循环;2002年05期

7 汪声恒，，黄友章;胎肌条件培养液抗损伤效应的观察[J];山西白血病;1994年04期

8 夏添,蒋德昭;用条件培养液代替重组因子培养小鼠高增殖潜能集落形成细胞[J];湖南医科大学学报;1998年02期

9 冯定庆;高婷;周颖;沈国栋;凌斌;;骨髓间充质干细胞条件培养液促进小鼠卵母细胞体外成熟的研究[J];生殖与避孕;2009年12期

10 朱勇,金伯泉,黄传书,刘雪松;条件培养液中杂交瘤生长因子对人—鼠杂交瘤生长、克隆化及抗体分泌的影响[J];中国免疫学杂志;1991年02期

中国重要会议论文全文数据库 前9条

1 曲爱兵;焦绿绮;;兔条件培养液对抗癌药骨髓抑制的调解[A];2000全国肿瘤学术大会论文集[C];2000年

2 张权;庞金辉;黄煌渊;;条件培养液对骨髓基质干细胞体外培养诱导成骨的影响[A];中华医学会第三次全国骨质疏松和骨矿盐疾病学术会议暨骨质疏松诊断技术继续教育学习班论文汇编[C];2004年

3 胡京红;王淑华;卢咏才;;淋巴细胞条件培养液和高脂血清对平滑肌细胞吞噬功能的影响[A];中华中医药学会中医药传承创新与发展研讨会专辑[C];2007年

4 赵惠萍;王绮如;卢光t;;条件培养液诱导鼠胚胎干细胞分化为造血干/祖细胞[A];第一届中华医学会生殖医学分会、中国动物学会生殖生物学分会联合年会论文汇编[C];2007年

5 黄艳红;谭孟群;王绮如;;基质细胞条件培养液中TGF-β对体外扩增巨核系细胞的影响[A];湖南省生理科学会新世纪学术年会论文摘要汇编[C];2002年

6 李天娇;黄艳红;罗四维;李杨;汉建忠;罗自强;;人肺腺癌A549细胞无血清条件培养液对A549细胞增殖的影响及机制初步探讨[A];湖南省生理科学会2013年度学术年会论文摘要汇编[C];2013年

7 黄艳红;谭孟群;雷军;王绮如;;基质细胞条件培养液中TGF-β对体外扩增巨核系细胞的影响[A];中国生理学会第21届全国代表大会暨学术会议论文摘要汇编[C];2002年

8 朱猛;孙茂民;夏春林;;1、2型星形胶质细胞培养及其生物学特性[A];解剖学杂志——中国解剖学会2002年年会文摘汇编[C];2002年

9 段辉;;玻璃体条件培养液对人视网膜色素上皮细胞生长活性及细胞周期的影响[A];中华医学会第十二届全国眼科学术大会论文汇编[C];2007年

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 段辉;玻璃体条件培养液对人视网膜色素上皮细胞生长活性影响及其机制的实验性研究[D];中国医科大学;2007年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 尹晓明;受照角质细胞HaCat产生电离辐射旁效应信号机制的研究[D];苏州大学;2015年

2 周杰;心肌细胞条件培养液的体外抗肿瘤作用及其机制研究[D];泸州医学院;2014年

3 滕继伟;催产素联合乳鼠心肌细胞条件培养液诱导胚胎干细胞分化的作用[D];第四军医大学;2010年

4 陈小永;损伤肝脏条件培养液体外诱导小鼠骨髓细胞分化为肝细胞的研究[D];浙江大学;2006年

5 杨晓丽;小鼠胚胎培养方法的研究[D];山西医科大学;2003年

6 赵旭生;骨髓间充质干细胞的营养效应对一氧化碳致星形胶质细胞损伤的影响[D];大连医科大学;2011年

7 张志伟;骨髓间充质干细胞条件培养液对心肌梗死后细胞凋亡的影响[D];苏州大学;2009年

8 贾敏;人晚孕蜕膜条件培养液对肿瘤细胞生物学作用的初步研究[D];重庆医科大学;2004年

9 王亚周;成年嗅神经鞘细胞条件培养液（AOCM）对PC12细胞分化和保护作用的研究[D];中国人民解放军第四军医大学;2003年

10 袁媛;外源性Wnt5a诱导K562细胞定向分化的研究[D];第三军医大学;2007年

本文编号：879956