电离辐射致骨损伤远端效应的细胞机制研究

发布时间：2017-10-07 22:18

  本文关键词：电离辐射致骨损伤远端效应的细胞机制研究

  更多相关文章： 远端效应 放射治疗 成骨细胞 条件培养基 电离辐射 共培养 Transwell板 肾小管上皮细胞

【摘要】：[研究背景和目的]随着肿瘤治疗手段和诊断方法的进步,肿瘤患者的生存率明显增加。放射治疗是临床恶性肿瘤治疗的一种有效的和不可缺少的方法。然而,放射治疗在杀死肿瘤细胞的同时可损伤正常组织,放疗后骨损伤包括骨质疏松及其骨折即是肿瘤放疗的远后期效应之一,且多数仅在发生骨折后才给予诊断,是常见的癌症放疗后遗症,病因不明,治疗手段缺乏。癌症放疗引起的骨骼并发症己在乳腺癌、脑癌、盆腔肿瘤和血液系统肿瘤等的临床研究中得到报道。而近年有临床研究和动物实验证据提示,即使是局部放疗也有可能引起全身性包括非受照区域骨骼的损伤效应即电离辐射致骨损伤远端效应(abscopal effect)。此外,由于腹腔等局部照射使腹腔内一些对骨代谢平衡有重要调控作用的器官如肾脏的功能发生改变,也可能是腹腔局部放疗引起区域性和全身性包括非受照部位骨骼的骨密度下降、骨质疏松和非脆性骨折发生率增加的发生机理之一。但有关局部放疗引起非受照区域骨骼损伤即癌症放疗相关骨损伤远端效应的病因机制尚不明确。本研究首先采用137Cs 7射线照射成骨细胞和。肾小管上皮细胞,同时建立细胞条件培养基方法、成骨细胞-成骨细胞共培养体系和肾小管上皮细胞-成骨细胞共培养体系,观察受照后细胞直接或/和条件培养基对未受照成骨细胞生物学功能,包括增殖、分化、体外矿化能力及其分化相关基因和凋亡的影响,探讨电离辐射致骨损伤远端效应及其细胞机制,有望为临床癌症放疗相关骨损伤远端效应的防治提供一个新的干预治疗靶点和理论依据。[研究方法]取大鼠头盖骨分离培养的原代成骨细胞和大鼠肾小管上皮细胞株(NRK-52E),传代后给予不同剂量(0,1,2,5,10Gy)1γ射线照射,照后24h收集照射后细胞条件培养基(ICCM)。用10%、20%浓度的照射后细胞条件培养基培养未受照OB,相差显微镜下观察细胞形态,MTT法观察ICCM对OB增殖的影响,PNPP偶氮法观察ICCM对OB碱性磷酸酶(ALP)活性的影响,茜素红(ARS)矿化结节染色并计算面积以观察OB体外矿化能力改变,RT-PCR半定量分析ICCM对成骨细胞ALP、OPG、OC等相关基因mRNA表达的影响,流式细胞仪用Annexin-FITC/PI双染法观察ICCM致OB凋亡改变。同时,采用Transwell培养板建立成骨细胞-成骨细胞共培养体系和肾小管上皮细胞-成骨细胞共培养体系,以进一步阐明受照(IR)成骨细胞或受照(IR)。肾小管上皮细胞对未受照(NR) OB生物学功能影响及其细胞机制。经5Gy137Cs γ射线照射后的成骨细胞或肾小管上皮细胞株NRK-52E,照后分别培养2,24,48,72h,再与未受照OB共培养以观察其生物学功能的改变；并采用不同剂量137Cs γ射线(0,1,2,5,10Gy)照射成骨细胞和大鼠肾小管上皮细胞株(NRK-52E),照后2h(OB)或72h (NRK-52E)与未受照成骨细胞共培养,观察未受照(NR) OB生物学功能如增殖、分化、矿化能力及相关基因和蛋白表达的改变,以探讨电离辐射致骨损伤的间接效应及其细胞机制。[研究结果]1. ICCM能调节成骨细胞生物学功能,表现为抑制增殖和分化,引起细胞死亡或凋亡。来自受照OB的条件培养基可使OB发生纤维细胞形态改变,细胞突起和突起连接均减少,10%和20%浓度的10Gy ICCM均使未受照的OB增殖受到明显抑制,差异有统计学意义(p0.01)。流式细胞仪测定发现40%浓度ICCM时,各照射剂量ICCM培养的成骨细胞凋亡率均较对照组(0Gy)高；10%浓度ICCM时5. 10Gy ICCM明显下调ALP活性；20%浓度ICCM时各照射剂量组ICCM均显著抑制ALP活性。ICCM对OB的体外矿化结节形成能力也呈明显抑制作用,加入2,5,10Gy的ICCM培养后细胞矿化结节面积分别减少33.9%,42.1%和50.8%(p0.05)。此外,20%浓度ICCM培养的成骨细胞分化相关基因ALP、OC、OPG mRNA表达也出现不同程度下调。2.共培养体系中未受照成骨细胞的增殖分化能力在2h就有明显下降(p0.05)。与对照组比较,与不同剂量受照OB共培养可使未受照OB的增殖和分化能力均呈不同程度降低,矿化结节面积在1Gy和2Gy时即明显减少。此外,共培养体系中OB相关基因ALP、OC、OPG mRNA表达较对照组明显降低(p0.001), RANKL/OPG比值升高；caspase3基因表达上调,在5Gy和10Gy剂量时有统计学意义(p0.05)。同时,随着照射剂量增大,ALP蛋白表达下调、caspase3蛋白表达上调(p0.05),并呈剂量-效应关系。3.受照NRK-52E细胞条件培养基对未受照成骨细胞增殖、ALP有一定影响作用。10%浓度ICCM作用时,10Gy照射组的NRK-52E细胞ICCM可引起未受照OB的增殖能力明显抑制；20%浓度ICCM作用时,不同剂量组的NRK-52E细胞ICCM对未受照OB的增殖和ALP活性均有不同程度抑制,且在10Gy和15Gy时抑制明显,有统计学差异(p0.05)。进一步应用建立的成骨细胞-肾小管上皮细胞共培养体系观察了其时间-效应,表明经5Gyγ射线照射后72h的NRK-52E细胞共培养,未受照成骨细胞的增殖、ALP活性均表现出明显抑制(F=14.212,p0.01)。剂量-效应研究进一步证明,受照后的肾小管上皮细胞与未受照成骨细胞共培养可导致成骨细胞增殖和ALP活性下降,且呈剂量-效应关系。其中,ALP活性降低在1,5,10Gy照射剂量时有统计学意义。[研究结论]1.采用细胞条件培养基方法和成骨细胞-成骨细胞共培养体系,证明了受照自体细胞对未受照成骨细胞生物学功能如增殖、分化和矿化,以及骨代谢相关基因和蛋白表达具有直接调节作用,并可引起未受照成骨细胞凋亡。成骨细胞受照后产生的某些细胞因子可能与电离辐射的非靶效应相关。2.受照后肾小管上皮细胞对未受照成骨细胞也具有直接调节作用,进一步证明了电离辐射致骨损伤远端效应的影响,初步揭示了癌症放疗引起的骨量丢失中肾-骨作用模式的可能。3.建立了肾小管上皮细胞-成骨细胞和成骨细胞-成骨细胞共培养体系,可用于进一步开展电离辐射致骨损伤远端效应包括肾-骨作用通路的细胞分子机制研究
【关键词】：远端效应 放射治疗 成骨细胞 条件培养基 电离辐射 共培养 Transwell板 肾小管上皮细胞
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R730.55
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-10
• 前言10-12
• 第一部分 受照自体细胞条件培养基对成骨细胞生物学功能的影响12-31
• 引言12
• 材料与试剂12-14
• 方法14-19
• 结果19-28
• 讨论28-30
• 小结30-31
• 第二部分 受照自体细胞对共培养成骨细胞生物学功能的影响31-43
• 引言31
• 材料与试剂31-32
• 方法32-36
• 结果36-41
• 讨论41-42
• 小结42-43
• 第三部分 受照肾小管上皮细胞对共培养成骨细胞增殖和分化能力的影响43-53
• 引言43
• 材料与试剂43-44
• 方法44-46
• 结果46-50
• 讨论50-52
• 小结52-53
• 全文小结53-54
• 参考文献54-60
• 综述 电离辐射远端效应研究现状60-67
• 参考文献64-67
• 致谢67-68
• 附录 在校期间参加学术会议、发表学术论文及获奖情况68-69
• 主要试剂配制69-70
• 英文缩略词表70-71

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 高林峰;王洪复;;电离辐射所致肾损伤引起的骨代谢异常的机制探讨[J];辐射研究与辐射工艺学报;2006年05期

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本文编号：990374