用荧光强度反映Cbfa1活性成骨细胞模型的构建及其应用研究

发布时间：2017-11-02 02:21

  本文关键词：用荧光强度反映Cbfa1活性成骨细胞模型的构建及其应用研究

  更多相关文章： 模拟微重力效应 成骨细胞分化 Cbfa1 荧光强度 PI3K信号通路

【摘要】： 在中长期太空飞行中,空间骨丢失对航天员健康的影响是目前航天医学关注的重点之一。研究表明,微重力条件下,成骨细胞分化功能降低,骨形成减少,特异性转录因子Cbfa1在此过程中起关键作用。研究重力因素对Cbfa1活性调节机制对于阐明空间骨丢失机理非常重要。 本研究以未分化的人成骨瘤细胞MG63为对象,利用回转器模拟微重力效应和细胞离心机实现超重,采用基因导入、信号途径干预剂处理等细胞分子生物学技术,研究不同重力因素对成骨细胞分化的影响,探讨重力因素对Cbfa1活性及成骨向分化、以及PI3K信号通路的影响;以期为空间骨丢失机理和对抗防护研究提供科学依据。主要获得以下研究结果: 1、合成了以6个Cbfa1结合元件为主要调控元件的miniOC启动子,并构建由该启动子驱动的EGFP报告基因真核表达载体,转染并筛选获得OSE-MG63成骨细胞模型,细胞的荧光强度能够反映Cbfa1的活性,为航天细胞搭载实验提供一种更为方便有效的研究模型。 2、模拟微重力环境下培养MG63细胞ERK1/2、p38、p85蛋白表达量均低于对照组(1G),并且随回转时间增加其抑制作用持续,表明微重力影响成骨细胞增殖分化的MAPK、PI3K信号途径。模拟微重力效应显著抑制PI3K的p85蛋白磷酸化水平,并且下调了Cbfa1的表达;相反,超重效应能够提高p85蛋白磷酸化水平,上调了Cbfa1的表达。 3、以构建OSE-MG63细胞模型为对象,采用不同重力条件与PI3K信号通路的阻断剂(LY294002)和激活剂(IGF-I)复合处理,结果显示:模拟微重力显著抑制OSE-MG63细胞的荧光强度,而超重则提高其荧光强度;IGF-I能够诱导Cbfa1活性提高,但由IGF-I诱导的荧光强度升高作用受到LY294002的显著抑制。表明模拟微重力减弱IGF-I的成骨作用,超重提高Cbfa1活性是通过PI3K信号通路。
【关键词】：模拟微重力效应 成骨细胞分化 Cbfa1 荧光强度 PI3K信号通路
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R85
【目录】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-8
• 第一章 综述8-21
• 1.1 空间骨丢失现象8-11
• 1.1.1 正常重力下的骨代谢9
• 1.1.2 成骨细胞的分化过程9-10
• 1.1.3 微重力对成骨细胞分化的影响10-11
• 1.2 骨向分化特异性转录因子CBFA111-14
• 1.2.1 Cbfa1 概况11-13
• 1.2.2 Cbfa1 的功能13-14
• 1.2.3 微重力对Cbfa1 的影响14
• 1.3 信号通路对CBFA1 的表达与活性影响14-18
• 1.3.1 Cbfa1 的表达及活性调节14-15
• 1.3.2 多种信号通路聚焦于Cbfa115-16
• 1.3.3 P13K-Akt 信号通路在成骨细胞分化中的作用16-17
• 1.3.4 微重力影响P13K-Akt 信号通路17-18
• 1.4 微重力下骨代谢的研究方法18-19
• 1.4.1 微重力模拟方法及其应用18-19
• 1.4.2 实时报告基因——绿色荧光蛋白GFP19
• 1.5 本研究的目的与意义19-21
• 第二章 构建用荧光强度反映CBFA1 活性的成骨细胞模型21-34
• 2.1 材料21-23
• 2.1.1 主要仪器21-22
• 2.1.2 试剂及其配制22-23
• 2.2 实验方法23-28
• 2.2.1 6OSE2 基因启动子扩增23-24
• 2.2.2 p6OSE2-EGFP 表达载体构建24-26
• 2.2.3 MG63 细胞培养、传代的方法26
• 2.2.4 G418 最小致死浓度确定26
• 2.2.5 脂质体法转染MG63 细胞26-27
• 2.2.6 OSE-MG63 稳定转染细胞株的筛选27
• 2.2.7 OSE-EGFP 稳定细胞株荧光强度分析27
• 2.2.8 细胞内碱性磷酸酶ALP 染色方法（改良Gomori 法）27-28
• 2.2.9 细胞培养液碱性磷酸酶ALP 活性测定方法28
• 2.3 结果与分析28-32
• 2.3.1 6OSE2 基因启动子扩增28-29
• 2.3.2 表达载体的鉴定结果29
• 2.3.3 G418 最小致死浓度的确定29
• 2.3.4 稳定转染6OSE2-EGFP 基因细胞株的筛选29-30
• 2.3.5 OSE-MG63 细胞株对骨向诱导剂的响应30-32
• 2.4 讨论32-34
• 第三章 不同重力条件对CBFA1 活性及信号通路的影响34-46
• 3.1 材料34-36
• 3.1.1 主要仪器34-35
• 3.1.2 主要试剂35-36
• 3.2 方法36-40
• 3.2.1 MG63 细胞在回转模拟微重力下的培养方法36
• 3.2.2 MG63 细胞在超重条件下的培养方法36-37
• 3.2.3 静止条件下加入P13K 激活剂及抑制剂培养MG63 的方法37
• 3.2.4 模拟微重力环境下加入P13K 激活剂培养OSE-MG63 的方法37
• 3.2.5 超重环境下加入P13K 抑制剂培养OSE-MG63 的方法37-38
• 3.2.6 细胞裂解及总蛋白提取38
• 3.2.7 细胞总蛋白浓度测定38-39
• 3.2.8 Western-Blot 检测信号分子蛋白表达39-40
• 3.2.9 OSE-MG63 细胞荧光强度分析方法（如2.3.7）40
• 3.2.10 细胞内ALP 染色方法（如2.3.8）40
• 3.3 结果与分析40-44
• 3.3.1 模拟微重力环境下p38、Erk1/2 和p85 蛋白表达变化40
• 3.3.2 不同重力环境对p85 及Cbfa1 蛋白表达的影响40-41
• 3.3.3 IGF-I 对p85 蛋白表达及磷酸化的影响41
• 3.3.4 模拟微重力环境下P13K 激活剂对Cbfa1 活性及骨向分化的影响41-42
• 3.3.5 超重环境下P13K 抑制剂对Cbfa1 活性及骨向分化的影响42-44
• 3.4 讨论44-46
• 结论46-47
• 参考文献47-53
• 附录53-56
• 致谢56-57
• 作者简介57

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 姜文雄;孟国林;刘建;杨鹏;李强;;Ι型骨质疏松山羊骨髓基质细胞体外成脂、成骨分化的研究[J];科学技术与工程;2006年21期

2 马晓环;魏力军;郑红霞;颜兴;李钰;;γ辐照与模拟微重力效应对大鼠终末分化PC12细胞损伤的研究[J];现代生物医学进展;2008年12期

3 仝飞飞;戴钟铨;郭飞马;丁柏;谭映军;吕金印;李莹辉;;用荧光强度反映Cbfa1活性成骨细胞模型的构建[J];航天医学与医学工程;2010年01期

4 郭飞马;戴钟铨;吴峰;商澎;李莹辉;;反映成骨细胞特异转录因子Runx2活性的细胞模型构建[J];航天医学与医学工程;2011年03期

5 徐小雅;金慰芳;高建军;周轶;;体外局部大剂量辐射对大鼠骨髓间充质干细胞分化的影响[J];核技术;2009年10期

6 孙平;蔡德鸿;黄震;;失重与骨代谢调节失衡[J];中国骨质疏松杂志;2006年05期

7 杨志;王冰;孙喜庆;张舒;;流体剪切应力对模拟失重条件下MG-63成骨样细胞Cbfα1表达的影响[J];航天医学与医学工程;2007年01期

8 陈静韵,丁焕文,王捷,杨汝德;用于骨移植的hCbfa1重组腺病毒载体的构建[J];华南理工大学学报(自然科学版);2005年08期

9 崔伟;细胞因子与骨代谢调节[J];航天医学与医学工程;1995年03期

10 戴钟铨,丁柏,李莹辉,张玉国,刘們們;稳定转染COL1 A1-EGFP基因的ROS17/2.8细胞株的建立[J];航天医学与医学工程;2004年02期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 郭勇;郭春;张西正;闫玉仙;李瑞欣;张春秋;王亮;;相同机械应力对成骨细胞分化和破骨细胞分化的影响[A];天津市生物医学工程学会第30次学术年会暨生物医学工程前沿科学研讨会论文集[C];2010年

2 舒晓春;刘君静;;不同浓度的骨碎补总黄酮对大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响[A];内分泌代谢病中西医结合研究——临床与基础[C];2010年

3 刘元林;江小霞;苏永锋;霍思维;朱恒;吴英;李秀森;张毅;毛宁;;活化的T细胞促进间充质干细胞分化为成骨细胞[A];第12届全国实验血液学会议论文摘要[C];2009年

4 卢瑛;;Apelin抑制血管平滑肌细胞向成骨细胞分化[A];中华医学会第六次全国骨质疏松和骨矿盐疾病学术会议暨中华医学会骨质疏松和骨矿盐疾病分会成立十周年论文汇编[C];2011年

5 林春博;谢富荣;杨渊;陈维平;;柚皮甙体外诱导兔骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的实验研究[A];第十八届全国中西医结合骨伤科学术研讨会论文汇编[C];2011年

6 郎红梅;金小岚;万勇;;低氧对骨髓基质细胞向成骨细胞分化影响的实验研究[A];中华医学会第三次骨质疏松和骨矿盐疾病中青年学术会议论文汇编[C];2011年

7 郎红梅;金小岚;万勇;;不同氧浓度对骨髓基质细胞向成骨细胞分化过程中骨形态蛋白及其受体表达的影响[A];中华医学会第三次骨质疏松和骨矿盐疾病中青年学术会议论文汇编[C];2011年

8 肖洲生;L.DarrylQuarles;陈清泉;，

本文编号：1129578