氮芥介导下的烷基转移酶MGMT与DNA的交联作用及其修复过程的研究
本文关键词：氮芥介导下的烷基转移酶MGMT与DNA的交联作用及其修复过程的研究
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【摘要】：研究背景芥类毒剂是一类重要的军用糜烂性毒剂,对皮肤、眼及呼吸道等有严重的致伤作用,其中呼吸道损伤是伤芥类毒剂损伤中最为难防难治且有明显的远后效应的。糜烂性毒剂氮芥是双功能烷化剂的一种,其分子内含有两个烃基,因而可分别与DNA和蛋白质发生反应,形成了共价稳定的DNA-蛋白交联(DNA-protein crossslink,DPC)。DPC是DNA损伤的一种形式,因其产生的巨大复杂的空间阻隔妨碍DNA的解旋和复制,产生基因毒作用和细胞毒作用。O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O6-methylguanine DNA methyltransferase,MGMT)能独立移除O6位点加合物,从而修复烷化剂引起的DNA损伤,在DNA直接修复途径中扮演着极为关键的作用。然而,现已发现MGMT对氮芥等双功能烷化剂引起的损伤修复不佳,原因在于此类烷化剂能分别以其两个烷化位点结合DNA及MGMT,形成MGMT-DNA交联(m DPC),从而使MGMT由DNA损伤修复酶转变为诱导DNA损伤的因子。DPC有多种修复方式,在高等真核细胞中较被重视的是同源重组(homologous recombination,HR)及新近报道的蛋白水解。现阶段,对氮芥介导的mDPC损伤效应、形成的影响尚无完全清晰的研究,而针对氮芥引起的m DPC的修复则尚未见报道。研究内容1.研究氮芥的损伤效应:以人支气管上皮细胞(human bronchial epithelial cell,16HBE)为模型,研究氮芥盐酸盐(mechlorethamine,也叫做N-methyl-2,2-di(chloroethyl)amine,HN2)染毒后细胞活力变化;在维持适宜细胞活力的染毒浓度条件下,研究HN2对DNA的损伤效应,以及诱导DPC形成的效应,并重点关注MGMT-DNA交联物(mDPC)的形成及其剂量依赖效应和时间效应关系。2.从MGMT表达量的角度,研究HN2介导形成mDPC的影响因素:利用转录调节因子c-MYC调控MGMT蛋白的表达水平,利用特异性抑制剂消耗MGMT,降低其蛋白水平,观察对mDPC及细胞中总DPC(total-DPC,tDPC)形成量的影响。3.研究m DPC的修复方式:观察细胞染后毒多种DNA损伤修复通路的激活情况及其时间效应;观察蛋白水解对dpc修复的影响,并重点关注在蛋白水解通路中新预测的蛋白dvc1在染毒后的表达情况、对dpc和mdpc的修复作用及其影响因素;初步探讨dvc1的分子功能;研究mgmt表达水平及mdpc水平对dvc1的影响。4.研究mgmt的降解途径:研究hn2染毒后mgmt是否通过泛素-蛋白酶体系统进行降解、降解过程的调节机制并阐明其时间依赖效应;研究泛素化对mdpc及tdpc降解(修复)过程的影响以及不同泛素化阶段对修复过程的作用差异。研究结果1.hn2染毒16hbe细胞后,细胞活力下降,存在剂量依赖效应,并在50μm染毒浓度时下降至正常活力80%。hn2染毒引起双链断裂(doublestrandbreak,dsb),表现为h2ax、nf-κbmrna及磷酸化蛋白表达增加。mgmtmrna及蛋白水平在染毒后呈下降趋势。染毒引起tdpc及mdpc含量显著上升,mdpc形成量呈剂量依赖性升高。mdpc及tdpc含量在时间上存在染毒后1h明显升高、6h短暂部分回落、24h重新升高的趋势。sirna干扰mgmt蛋白表达将抑制mdpc的形成。2.未染毒的情况下,sirna干扰mgmt表达后,γ-h2ax的表达明显上升。但在染毒后,mgmt缺失细胞其γ-h2ax的升高程度低于mgmt正常表达细胞,表现出dsb损伤程度降低。染毒对mgmt转录负向调控因子c-myc的mrna及蛋白表达无影响。c-myc特异性抑制剂10058-f4处理细胞能明显升高mgmt的表达,但在染毒后,mgmt的升高水平会被逆转。抑制c-myc合并染毒使-h2ax、mdpc含量升高,但对tdpc含量影响不明显。mgmt特异性底物o6bg能降低mdpc的形成,但短暂处理则会代偿性增加mdpc的含量。3.hr相关基因fancd2、brca2及rad51mrna在染毒后均发生上调,其中fancd2蛋白在染毒后1-6h也升高,而rad51蛋白表现不明显。细胞周期及dna损伤相关chk2mrna在染毒后也升高。其余损伤修复通路的改变不明显。蛋白酶体抑制剂mg132处理后tdpc及mdpc含量均升高。生物信息学预测的高等真核细胞中蛋白水解通路相关蛋白dvc1mrna及蛋白在染毒后表达均上调,且dvc1缺失后mdpc形成增加、tdpc修复速率降低。dvc1具有20s蛋白酶体活力,且其修复作用是p97依赖的。细胞mgmt水平的降低会使dvc1的表达下降。4.mgmt在染毒后以原型及泛素化形式存在。mgmt的泛素化随染毒后时间延长而增加。mgmt同时存在小泛素样化(smallubiquitin-likemodifiers,sumo),sumo化随染毒后时间延长而减轻,与泛素化相反。蛋白酶体抑制后泛素化mgmt含量升高,而e1泛素激活酶抑制后泛素化mgmt含量降低。dvc1缺失表现出类似蛋白酶体抑制的结果。E1、E2、E3泛素酶抑制剂处理后t DPC修复速率降低,且E2、E3抑制剂的影响强于E1抑制剂。三种泛素酶抑制同样影响mDPC的修复速率,但E1抑制后影响更强。研究结论HN2能造成明显的细胞损伤及DNA损伤,促进DPC的形成,并优势地交联MGMT。m DPC的形成受HN2及MGMT含量的影响。HN2染毒能够激活HR修复途径中的相关因子,但未见其他DNA损伤修复途径的激活。在修复HN2引起的DPC时,蛋白水解参与其中,且DVC1是蛋白水解途径修复DPC的一个重要蛋白,具有20S蛋白酶体活性,对mDPC及t DPC的修复有着重要作用。DVC1对mDPC的修复作用是依赖p97的。m DPC的修复重点是MGMT的降解。MGMT通过泛素-蛋白酶体系统降解,其泛素化程度随染毒后时间延长而增加,并依赖SUMO化的呈递,与SUMO化水平呈互补平衡。抑制泛素化将明显降低t DPC及mDPC的清除速率。
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R82
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，本文编号：1213227
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