缺氧复合梭曼中毒PC12细胞中JAK-STAT信号通道变化的研究

发布时间：2017-12-10 22:03

本文关键词：缺氧复合梭曼中毒PC12细胞中JAK-STAT信号通道变化的研究

【摘要】： 梭曼属于速杀性化学战剂，可以迅速地抑制乙酰胆碱酯酶(AchE)，导致胆碱能神经末梢释放的乙酰胆碱(Ach)积累，引发动物出现呼吸困难、肌颤、惊厥，甚至死亡。快速进驻高原地区可造成机体缺氧性损伤，高原缺氧复合梭曼中毒可加大其毒性。这种低氧复合梭曼中毒所致的脑损伤至今对其发病机制尚不十分清楚，因而也缺少有效的防治措施。JAK-STAT传导通路是最近发现的信号传导通路，许多生理及病理生理反应都是由这一系统介导而发生的继发效应。然而JAK-STAT传导通路在缺氧复合梭曼中毒脑损伤中的作用机制还未见研究。目的：本研究利用PC12细胞、大鼠的缺氧及梭曼中毒模型，观察了缺氧及缺氧复合梭曼中毒脑组织JAK-STAT的信号传导过程的功能变化及组成这一传导途径的信号蛋白分子的基因转录和表达的变化，旨在阐明缺氧及缺氧复合梭曼中毒脑损伤信号传导通道及其构成的分子基础，为高原缺氧复合梭曼中毒脑损伤的预防和临床救治提供一种新的研究思路。方法：本实验应用流式细胞仪、免疫组化、蛋白印迹、RNA 印迹和逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、双脱氧链终止法测序等方法，从整体动物水平和细胞水平观察了缺氧、梭曼中毒单一与复合缺氧致伤后JAK-STAT信号传导通路各信号分子表达状况。结果及结论： 1．缺氧或梭曼中毒后PC12细胞的存活率呈下降趋势,且随缺氧或梭曼中毒时间的延长,存活率降低越明显；缺氧复合梭曼中毒后PC12细胞活性随时间延长而递减，在24h明显低于其它时相点。提示缺氧或梭曼中毒均能对PC12细胞产生毒性，在复合致伤的作用下，细胞毒性加大，细胞存活率在损伤后呈进行性下降、损伤程度具有早而重的特点。 2. 缺氧或梭曼中毒能刺激PC12细胞IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-13的分泌。作用2h活性升高，6h(12h)活性水平最高，12h(24h)活性降低；其它组均低于作用6h(12h)组。缺氧复合梭曼中毒组6h活性水平最高，明显高于梭曼中毒组和正常对照组。缺氧或梭曼中毒刺激PC12细胞表达IL-6 mRNA、GP130 mRNA和GP130蛋白； 2h水平 WP=9 升高，6h (12h) 水平最高，12h (24h) 水平降低；其它组均低于作用6h (12h) 组。缺氧复合梭曼中毒组6h表达水平最高，明显高于梭曼中毒组和正常对照组。提示缺氧和或梭曼中毒均可刺激JAK—STAT信号传导通路的上游分子--IL分泌增多，在复合致伤的作用下，这种效应加重并且时间提前。 3．缺氧或梭曼中毒可激活PC12细胞胞浆、胞核的酪氨酸蛋白激酶 (TPK)活性，6h (12h) 水平最高，12h (24h) 水平降低；其它组均低于作用6h (12h) 组。但PC12细胞胞膜的TKR活性降低。在复合致伤的作用下，这种效应加重并且时间提前。提示酪氨酸蛋白激酶在缺氧复合梭曼中毒过程中细胞内信号传递方面起了重要的作用。 4. 缺氧或梭曼中毒可引起PC12细胞的JAK1、2、3 mRNA和p-JAK1、2和JAK3蛋白表达水平升高，6h (12h) 水平最高，12h (24h) 水平降低；其它组均低于作用6h (12h) 组。缺氧复合梭曼中毒组6h表达水平最高，明显高于梭曼中毒组和正常对照组。TYK2在正常组或低氧处理细胞中均不表达。RT-PCR产物直接测序证实扩增产物片断与Genbank中相应序列相同。提示缺氧或梭曼中毒均可增强PC12细胞中JAK基因和蛋白的表达。复合致伤的作用下，可增加JAK基因和蛋白的表达量，并且时间提前。 5. 缺氧或梭曼中毒可引起PC12细胞的STAT1、2、3、5、6 mRNA和磷酸化蛋白表达水平升高，，6h (12h) 水平最高，12h (24h) 水平降低；其它组均低于作用6h (12h) 组。缺氧复合梭曼中毒组6h表达水平最高，明显高于梭曼中毒组和正常对照组。STAT4未见表达。RT-PCR产物直接测序证实扩增产物片断与Genbank中相应序列相同。免疫组化显示缺氧复合梭曼中毒6h，脑组织海马、皮层神经细胞中p-STAT1、3、5阳性染色较弱，主要分布于细胞核内， 12h组时阳性表达达高峰，胞核染成棕褐色。提示缺氧或梭曼中毒均可增强PC12细胞中STAT基因和磷酸化蛋白的表达。复合致伤的作用下，可增加STAT基因和磷酸化蛋白的表达量，并且时间提前。 6. 缺氧可引起PC12细胞的HIF 1α、HIF 1β mRNA和蛋白表达水平升高，6h水平最高，12h水平降低；其它组均低于作用6h组。缺氧后NF-κB的活性6h达到高峰，12h水平降低。加入JAK2的抑制剂AG490后缺氧6h NF-κB的活性明显降低。提示在缺氧的条件下，JAK-STAT信号通路也可介导对缺氧损伤的保护作用。 7．正常情况下PC12细胞中c-fos阳性较弱，主要分布于细胞核内，梭曼中毒6h后阳性着色明显增强，染色呈棕黄色；在缺氧复合梭曼中毒6h胞核内阳性着色显著增强，染色呈深棕黄色，加入抑制剂AG490后胞核内的阳性着色减弱。提示c-fos可能是JAK-STAT信号传导通路的下游分子，在高原缺氧复合梭曼中毒脑损伤机制中起重要的作用。综上所述缺氧和/或梭曼中毒作用后PC12细胞的JAK-STAT信号传导通路及其组成这一通路的各信号分子的表达发生变化，推测JAK－STAT信号传导通路参与了高 WP=10 原缺氧复合梭曼中毒脑损伤机制，从而为高原缺氧复合梭曼中毒脑损伤的救治新药物的研究提供新的思路。
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：R82

【参考文献】

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