“脑神经血管单元”体外模型的成模性研究

发布时间：2016-10-09 14:32

  本文关键词：“脑神经血管单元”体外模型的成模性研究，由笔耕文化传播整理发布。

《西南大学》 2013年

“脑神经血管单元”体外模型的成模性研究

薛强  

【摘要】：背景： “脑神经血管单元”是包括大脑神经元、胶质细胞、微血管等在内的一个整体概念,在脑神经血管疾病的研究和治疗中具有重要意义。课题组前期用原代培养的大鼠大脑皮层神经元、星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞,采用Tanswell细胞培养小池,在体外初步建立了“脑神经血管单元”整体结构模型,但其方法还不够稳定成熟,对于整体结构的关联性及其与在体功能的吻合性的验证还不足。本文的研究是在前期工作基础上进行方法学的改进、稳定,使其成熟,并验证其整体结构的相互关联性及其与在体“脑神经血管单元”功能的相似性 本课题获得了教育部博十学科点专项基金(博导类：20110182110012)；重庆市卫生局中医药科研重大项目(渝中医2010[60]2010-1-4)的支持。 目的： 1.改进并稳定建模用三种细胞的分离培养方法和神经血管单元三细胞共培养模型建立方法,为进一步研究提供稳定成熟的技术手段。 2.研究细胞特异性蛋白在缺氧复氧损伤不同时间点的表达及其相互关系,验证体外建立的“脑神经血管单元”模型与在体功能的相似性。 方法： 1.建模用三种大鼠脑细胞分离、培养与纯化鉴定方法的改进和稳定 建立大鼠脑皮层微血管内皮细胞分离、培养与纯化鉴定新方法本研究直接将25%的BSA加入获取的皮质层碎块中,匀浆后梯度离心取微血管段,用0.1%的Ⅱ型胶原酶消化获取微血管内皮细胞,用含20%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养,不添加生长因子,在传代时通过差异消化法纯化,用兔抗Ⅷ因子进行鉴定。 大鼠脑皮层神经元细胞分离、培养、纯化与鉴定方法的改进改进课题组前期用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基,用阿糖胞苷抑制非神经元细胞生长来纯化,用神经元特异烯醇化酶(NSE)进行鉴定的方法：本研究中,采用DMEM/F12培养基添加无血清B27进行培养与纯化,用神经元特异性微管相关蛋白质2(MAP-2)进行鉴定。 大鼠脑皮层星形胶质细胞分离、培养与纯化鉴定方法的稳定方法同课题组前期方法：分离新生3d内大鼠皮质层星形胶质细胞,用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养,通过摇瓶去除非星形胶质细胞,用兔抗GFAP鉴定。 2.“脑神经血管单元”体外共培养模型建立方法的改进与稳定 改变前期选用半透明transwell培养小池,神经元培养传代后接种到培养孔底,0.4mL/孔星形胶质细胞混悬液接种,培养2d后接种微血管内皮细胞的方法。本研究选用透明的transwell培养小池,神经元直接接种在培养板孔底培养纯化,在transwell膜外侧种植1mL的星形胶质细胞混悬液,贴壁后将小池插入神经元培养孔,1d后在transwell膜内侧种植纯化的脑微血管内皮细胞,共培养3d后用于模型评价和相关实验。通过倒置相差显微镜观察三种细胞生长状态、检测4h渗漏试验和跨内皮细胞电阻值,评价模型构建成功与否,评价正常培养时,该模型屏障功能与在体生理条件下的相似性。 3.“脑神经血管单元”体外共培养模型氧复氧损伤方法的建立与稳定 将建模成功的培养池内培养基换成无血清缺氧液,放入持续通入混合气体的、37℃恒温恒湿的缺氧装置中处理4h,再将缺氧液换成复氧液,于正常培养条件下培养。通过倒置相差显微镜观察模型中三种细胞生长状态、检测4h渗漏试验和跨内皮细胞电阻值,评价模型缺氧复氧损伤的成功与否；评价缺氧复氧损伤后,该模型屏障功能变化与在体病理条件下的相似性。 4.“脑神经血管单元”体外模型缺氧复氧损伤中细胞特异性蛋白动态变化研究 在缺氧前、复氧0h、复氧2h、复氧6h、复氧12h及复氧24h六个时间点分别提取不同培养方式下三种细胞蛋白,经过前处理后用WB方法检测神经元GAP-43、微血管内皮细胞Claudin-5、星形胶质细胞AQP-4的表达。通过比较上述功能蛋白在缺氧复氧损伤时表达变化与在体缺血再灌注损伤过程中表达变化,评价缺氧复氧损伤后,该模型中细胞功能变化与在体病理条件下的相似性。 结果： 1.方法改进后,分离培养的三种建模用新生大鼠脑原代培养细胞形态均一呈现出各自典型的生长特征。经特异性蛋白鉴定,神经元纯度达95%以上,较改进前提高10%；星形胶质细胞纯度达96%以上,较改进前提高6%；微血管内皮细胞纯度达99%以上,较改进前提高4%。改进后的脑微血管内皮细胞培养方法操作简单,耗时短,不需添加昂贵的生长因子,且节约动物使用量。 2.本研究采用透明transwell膜来改进了课题组前期用半透明transwell膜建立三细胞共培养模型的方法,并优化建模中细胞种植时间、数量等条件,建立了稳定的三细胞共培养模型,不仅使建模时间缩短,而且便于直接观察细胞生长状态和拍照。三细胞共培养体中,细胞共生长良好,星形胶质细胞胞体粗大并充分伸展、微血管内皮细胞形成单层、神经元轴突形成致密的网络,基本符合在体生长形态。通过比较单细胞培养、双细胞共培养和三细胞共培养生长结果,表明三细胞共培养模型细胞之间具有明显的相互促进生长的整体协同效应。4h渗漏试验中各孔液面均无明显下降,跨内皮细胞电阻值达到268.3±6.5(Ωcm2)。表明该模型具有“脑神经血管单元”中基本的屏障功能,相似于在体“脑神经血管单元”的部分生理功能。 3.缺氧复氧损伤后,三种细胞形态变化较大。脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞均不同程度出现胞体回缩,细胞间隙增加,神经元突触缩短并减少,但三细胞共培养模型中细胞形态受损程度小于双细胞共培养和单细胞培养。显示三细胞共培养体缺氧复氧损伤后,与在体脑组织缺血再灌注损伤后细胞形态变化相似,而且较单细胞或双细胞培养具有更强的抗损伤能力。与损伤前相比：三细胞共培养体4h渗漏试验降低显著(P0.01)。跨内皮细胞电阻值为227.1±3.3(Q cm2),下降明显(P0.01)。显示缺氧复氧损伤后。该三细胞共培养模型具有相似于在体“脑神经血管单元”缺血再灌注损伤的细胞病理变化。 4.双细胞共培养和单细胞培养时,神经元GAP-43和微血管内皮细胞Claudin-5的表达在复氧后0-2h就极显著降低(P0.001);三细胞共培养体中,神经元GAP-43在复氧后6h才开始明显降低(P0.05),该两种蛋白在复氧后12h才达到极显著降低(P0.001)。双细胞共培养和单细胞培养时,星形胶质细胞AQP-4的表达在复氧后0-2h就极显著升高(P0.001)；在三细胞共培养体中,其表达在复氧后2h才显著升高(P0.05),在复氧24h时才达到极显著升高(P0.001)。显示缺氧复氧损伤后,三细胞共培养体与在体脑组织缺血再灌注损伤后细胞蛋白变化相似,而且较单细胞或双细胞培养具有更强的抗损伤能力。该三细胞共培养模型具有相似于在体“脑神经血管单元”缺血再灌注损伤的细胞蛋白病理变化。 结论： 1.本研究建立了一种新的大鼠脑微血管内皮细胞原代培养方法,改进了大鼠脑皮层神经元原代培养方法,稳定了大鼠脑皮层星形胶质细胞原代培养方法。所获得的大鼠脑皮层三种原代细胞纯度较高,为后续研究提供了稳定的细胞培养方法,也可作为相关研究细胞培养的技术参考。 2.本研究改进并稳定了“脑神经血管单元”体外模型建模方法,使建模时间缩短,且便于直接观察细胞生长状态和拍照。所建模型中的三种脑细胞具有类似于在体脑组织细胞之间相互促进生长的作用,具有生理屏障功能。显示所建立的模型具有与在体“脑神经血管单元”相似的部分生理功能。 3.本研究建立了稳定的“脑神经血管单元”体外模型缺氧复氧损伤方法。该方法损伤后,“脑神经血管单元”体外模型具有相似于在体脑组织细胞的病理形态学变化特点。该方法损伤后“脑神经血管单元”体外模型中神经元GAP-43、微血管内皮细胞Claudin-5和星形胶质细胞AQP-4的表达,具有类似于在体缺血再灌注损伤后脑组织细胞蛋白的变化特点。 4.与单细胞培养或者双细胞培养比较,三细胞共培养模型细胞之间具有明显的相互促进生长的整体协同效应。“脑神经血管单元”体外模型中细胞在缺氧复氧损伤条件下,更加具有类似于在体脑组织细胞之间相互保护、增强抵御损伤能力的作用。 5.综上所述,本研究改建了“脑神经血管单元”体外模型。所获得的“脑神经血管单元”体外模型,较之单细胞培养或者双细胞培养模型,更具有类似于在体的“脑神经血管单元”的主要细胞成分、基本形态结构,基本生理功能、基本病理变化特点,可作为脑神经血管疾病及其治疗药物筛选的体外研究工具。

【关键词】：
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R965.1
【目录】：

下载全文 更多同类文献

CAJ全文下载

(如何获取全文？ 欢迎：购买知网充值卡、在线充值、在线咨询)

CAJViewer阅读器支持CAJ、PDF文件格式

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 刘光伟,龚守良;细胞凋亡的线粒体调控机制与电离辐射[J];国外医学(放射医学核医学分册);2003年02期

2 王艳竹;刘群;孟繁峥;江汉秋;黄庆梅;王丹;;星形胶质细胞AQP4蛋白在缺氧/复氧条件下表达变化的研究[J];中国实用神经疾病杂志;2010年09期

3 王建平;渠文生;张强;李昕;谢敏杰;喻志源;王伟;;缺血缺氧对星形胶质细胞合成和分泌BDNF的影响[J];郑州大学学报(医学版);2008年03期

4 王静娥;田国萍;周进;李丽;朱峰;徐冰;刘云会;;大鼠脑缺血时紧密连接相关蛋白occludin和claudin-5表达的变化[J];解剖科学进展;2010年02期

5 郭宗君,丰岩清,郭云良;脑缺血再灌注后脑梗塞周围区生长相关蛋白-GAP43表达的变化及外源性神经生长因子的影响[J];解剖学杂志;2000年06期

6 皇甫超申;牛保华;席艳;;脑血管内皮细胞损伤对大鼠脑缺血再灌注神经元凋亡的影响[J];河南大学学报(医学版);2005年04期

7 陈英辉;赵永波;呙登俊;王乃东;马爱梅;王乔树;刘文文;;水通道蛋白4在大鼠脑缺血再灌注损伤中的作用[J];临床神经病学杂志;2006年03期

8 熊世勤,朱锡华;Caspase激活与调控的分子机制[J];生物化学与生物物理进展;2000年01期

9 雷静;章平;钱旻;;几种细胞凋亡检测方法的比较[J];生物技术通讯;2005年06期

10 杨连君;司晓辉;王文亮;王文勇;赵一岭;方正清;;六种染色后光镜观察法检测肝癌细胞凋亡[J];实用医技杂志;2006年01期

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 汪承润,闵莉,吴薇,薄军;钬元素对小鼠肝脏细胞DNA损伤的影响[J];癌变.畸变.突变;2004年04期

2 奚卉;;冰片促进血脑屏障开放机制的探讨[J];安徽医学;2009年06期

3 廖华宁;汪宁;王艳;;紧密连接蛋白与血脑屏障[J];安徽医药;2012年03期

4 朱国旗;汤立建;王磊;苏婧婧;汪宁;彭代银;李庆林;;黄芩苷诱导人乳腺癌细胞株MDA-MB-231凋亡作用的研究[J];安徽中医学院学报;2008年02期

5 牛艳玲,曹胜利,蒋宇扬,杜伟,赵玉芬;N-磷酰化二肽甲酯诱导K562细胞凋亡[J];癌症;2002年08期

6 徐扬,何斌,王雅杰,付强;Herceptin与阿霉素联合应用对大鼠心脏毒性的影响[J];癌症;2004年04期

7 朱德元;;不同运动训练长期停训后Bax、Bcl-2在大鼠脾组织表达的形态学研究[J];北京体育大学学报;2007年S1期

8 许之屏;谭军;刘祥梅;;低强度耐力训练后力竭运动大鼠睾丸p53蛋白表达和部分功能酶活性的变化[J];北京体育大学学报;2010年08期

9 马艳;张明军;孔淑珍;;不同运动负荷对大鼠肺细胞凋亡的影响机制[J];北京体育大学学报;2011年07期

10 冯涛 ,王拥军 ,朱克;地塞米松对成年大鼠持续性局灶性脑缺血后凋亡和Bcl-2蛋白表达的影响[J];北京医学;2004年05期

中国重要会议论文全文数据库 前5条

1 ;大鼠脑微血管周细胞的分离和鉴定[A];中国微循环学会2011年全国学术会议论文汇编[C];2011年

2 杨大平;李军;黄晓欣;张爱华;何云;谢政军;;细胞凋亡在燃煤型砷中毒肝损伤中的作用[A];贵州省环境诱变剂学会第二届学术交流会论文集[C];2005年

3 李奎;李建华;方丽云;王超;刘英;康相涛;;细胞凋亡基因p53在固始鸡免疫器官内的表达及其生理意义[A];河南省畜牧兽医学会第七届理事会第二次会议暨2008年学术研讨会论文集[C];2008年

4 文珠;胡国柱;何丹;俞火;戎吉平;;川芎嗪对长春新碱导致的骨髓基质细胞生长抑制和凋亡的干预[A];第九届中国中西医结合实验医学学术研讨会论文汇编[C];2009年

5 刘建勋;林咸明;;不同时程电针预处理对脑缺血大鼠血脑屏障功能的保护效应[A];2013浙江省物理医学与康复学学术年会暨第八届浙江省康复医学发展论坛论文集[C];2013年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 李志清;蛛网膜下腔出血后血脑屏障通透性变化及其调控机制研究[D];中国医科大学;2010年

2 陆政峰;人参皂甙Rg1强化嗅鞘细胞生物学行为的实验研究[D];苏州大学;2010年

3 赵祯;绿茶多酚对脑缺血大鼠血脑屏障的保护作用及机制的研究[D];中国医科大学;2009年

4 谢利红;~（60）COγ射线照射对豚鼠耳蜗损伤及乙酰半胱氨酸辐射防护的实验研究[D];广西医科大学;2011年

5 满玉红;瑞香素对前脑缺血再灌注大鼠保护作用的实验研究[D];吉林大学;2011年

6 康春燕;模拟微重力下人肺微血管内皮细胞凋亡信号通路及药物干预[D];中国人民解放军军医进修学院;2011年

7 方鑫;神经炎症在帕金森病发病机制中的作用[D];华中科技大学;2011年

8 周英武;人参皂苷Rg1对树突状细胞效应与分子机制的研究[D];北京中医药大学;2011年

9 卢婷婷;经鼻给予人参皂苷Rb1的脑靶向性及其对大鼠脑梗死的治疗作用[D];南京大学;2011年

10 曹长姝;中药臭灵丹中HTMF体外抗肿瘤机制研究[D];暨南大学;2011年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 高明;女贞子有效成分齐墩果酸对S180荷瘤小鼠P53蛋白表达及TNF-α的诱生作用[D];黑龙江中医药大学;2010年

2 黄海涯;水翁花逆转肝癌多药耐药的有效成分及分子机制[D];华东理工大学;2011年

3 何雪;缺氧对大鼠脑微血管内皮细胞PI3K/Akt信号通路及神经血管单元的影响[D];浙江大学;2011年

4 辛慧;甘氨胆酸对小鼠脾淋巴细胞凋亡的影响[D];内蒙古农业大学;2010年

5 黄雪芳;龙眼肉多糖硫酸酯化修饰及修饰前后体外抗肿瘤活性初步研究[D];广西医科大学;2011年

6 文曙光;小鼠大脑神经干细胞和血管的关系[D];河南大学;2011年

7 白彩艳;盐酸小檗碱对大鼠急慢性心肌缺血的保护作用[D];吉林大学;2011年

8 马强;“脑神经血管单元”体外模型的构建及梓葛冻干粉对其缺氧缺糖损伤的保护研究[D];西南大学;2011年

9 赵丹红;家蚕BmICE-912基因的克隆与功能研究[D];西南大学;2011年

10 张明珠;普洱茶联合人参皂苷抗肿瘤及抗顺铂副作用[D];北京中医药大学;2011年

【二级参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 袁小鹏,焦伟华,徐如祥;肿瘤细胞AO/EB荧光染色法在药敏试验中的可行性探讨[J];癌症;1999年03期

2 王守彪;早期康复训练对大鼠脑缺血半影区GAP-43和P38 mRNA表达的影响[J];青岛大学医学院学报;2003年02期

3 张毅,郭瀛军,王芳,高远舰,颜宏利,孙树汉;Annexin B1:一种新的细胞凋亡检测用蛋白[J];第二军医大学学报;2003年03期

4 杨连君,王文亮,司晓辉;乙醇诱导肝癌细胞凋亡的形态学观察[J];第四军医大学学报;2001年16期

5 冯社军;刘鸣;李卫征;李伟;张世洪;;脑卒中患者复发及其影响因素研究[J];南方医科大学学报;2009年05期

6 李志欣;磁共振功能成像对脑缺血半暗带的研究进展[J];国外医学(临床放射学分册);2002年02期

7 柯绍发;张可浩;蔡菊芳;张艳;金笑平;;急性脑出血后灶周脑组织水通道蛋白-4的表达[J];中国实用神经疾病杂志;2007年04期

8 张梅;王伟平;;依达拉奉治疗急性脑梗死的疗效观察与护理[J];中国实用神经疾病杂志;2007年07期

9 刘丽波;杨智航;刘丽;付伟;薛一雪;;缓激肽对脑胶质瘤大鼠紧密连接影响的形态学观察[J];解剖科学进展;2007年03期

10 刘丽波;刘云会;解辉;王萍;薛一雪;;EMAP-Ⅱ选择性增加胶质瘤大鼠血肿瘤屏障通透性[J];解剖科学进展;2008年02期

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 种衍军,李志海;神经血管减压术治疗老年人三叉神经痛[J];中华老年医学杂志;1999年03期

2 李萍,孙志庭,米修奎,赵永宏,冯勃;神经血管减压术治疗半面痉挛的听力损害分析[J];航空军医;1995年05期

3 孙国生,牛庆云;利用废旧头部神经血管标本制作头部颅骨的瓶装标本[J];解剖科学进展;2001年03期

4 段志斌 ,李秋芳 ,郝振家 ,刘卫平 ,李侠;显微神经血管减压术治疗原发性三叉神经痛53例临床分析[J];山西医药杂志;2004年05期

5 黄伟;用带神经血管游离肌肉瓣治疗面瘫[J];上海口腔医学;1994年02期

6 王鸿飞;安丽;;阿尔茨海默病的发病机制及营养调节[J];国际老年医学杂志;2010年05期

7 王堃,张秀艳;肱骨骨折致神经血管肌肉离断1例报告[J];中国矫形外科杂志;1997年03期

8 黄结玲;对固定肢体的神经血管状况评估[J];国外医学.护理学分册;2003年04期

9 ;颈部带状肌的神经血管支配[J];国外医学.耳鼻咽喉科学分册;2000年01期

10 王渝云;肢体骨折后神经血管检查的五要点[J];国外医学.护理学分册;1994年01期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 陈亮;李世荣;曹川;;25例面部改型术分析[A];中国康复医学会修复重建外科专业委员会第十四次全国学术交流会论文集[C];2004年

2 李赫;金晓光;祁丽艳;胡涛;黄宁;;治疗单纯臀部锐器伤的几点体会(摘要)[A];第五次全国创伤康复暨第七次全国运动疗法学术会议论文汇编[C];2004年

3 姜宏;张守会;;银质针治疗髋关节及其周围软组织损伤[A];第九届全国软组织疼痛学术会议暨首届中华医学会疼痛学会软组织疼痛年会论文汇编[C];2004年

4 马爱梅;赵永波;;偏头痛药物治疗[A];中华医学会第七次全国神经病学学术会议论文汇编[C];2004年

5 郭春妮;赵永波;;钙通道基因CACNA1A突变与偏头痛[A];中华医学会第七次全国神经病学学术会议论文汇编[C];2004年

6 俞永林;吴建国;;颈丛封闭治疗颈丛神经受压引起的颈肩痛[A];全国软组织疼痛微创技术专题研讨会论文汇编[C];2004年

7 黎秉衡;潘淑贤;黎迅;黎坚;;强的松龙颈根注射及整脊治疗颈胸段后突症的体会[A];第九届全国软组织疼痛学术会议暨首届中华医学会疼痛学会软组织疼痛年会论文汇编[C];2004年

8 蔡健;蒋海波;;阴茎血流动力学检查在ED病因诊断中的应用[A];全国性与生殖医学学术研讨会论文汇编[C];2004年

9 朱千峰;;人身损害后合并医疗不当鉴定3例[A];全国第七次法医学术交流会论文摘要集[C];2004年

10 彭爱芳;;腕部切割伤神经血管吻合术后患者的护理[A];全国第六届骨科护理学术交流暨专题讲座会议论文汇编[C];2004年

中国重要报纸全文数据库 前10条

1 本报记者 王纯;[N];健康时报;2003年

2 易元;[N];江苏科技报;2004年

3 本报记者 王峰;[N];中国消费者报;2000年

4 刘宁春 杨丽佳;[N];健康报;2005年

5 本报记者 王峰;[N];中国消费者报;2002年

6 张天华;[N];大众卫生报;2004年

7 马庆华;[N];保健时报;2003年

8 杨丽华;[N];大众卫生报;2004年

9 本栏由鄂美猪种改良公司技术部特约刊登 特约通讯员 胡绪翠;[N];湖北科技报;2005年

10 于惠中;[N];中国医药报;2003年

中国博士学位论文全文数据库 前3条

1 张晓宏;（侧）颅底神经血管区：多层面CT和高场强MR影像解剖学研究[D];第四军医大学;2002年

2 朱巍;转基因神经干细胞移植对脑缺血后神经血管保护作用的研究[D];复旦大学;2003年

3 胡凡;天幕裂孔区显微解剖及手术入路研究[D];复旦大学;2003年

中国硕士学位论文全文数据库 前8条

1 朱炼;跟骨周围神经、血管的体表投影测量及其临床意义[D];河北医科大学;2007年

2 李建民;肱骨髁上骨牵引相关解剖学研究及临床应用[D];河北医科大学;2008年

3 侯团结;胸背动脉肌皮穿支瓣的解剖学研究与临床意义[D];安徽医科大学;2004年

4 辛善栋;颅后窝内耳道周区锁孔入路的显微神经外科解剖及临床应用[D];青岛大学;2003年

5 张振海;经枕下乙状窦后入路小脑桥脑角的显微解剖及神经内窥镜解剖研究[D];中国人民解放军第一军医大学;2003年

6 齐向东;颞肌与帽状腱膜复合组织瓣动态矫正晚期面瘫的应用基础研究[D];第一军医大学;2002年

7 杨利霞;三叉神经痛病因诊断的MRI研究[D];新疆医科大学;2003年

8 秦丽娜;穴位透刺与循经远取相结合治疗偏头痛的临床研究[D];黑龙江中医药大学;2004年

  本文关键词：“脑神经血管单元”体外模型的成模性研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：134949