体内外暴露二乙烯砜生成新DNA加合物的合成、性质和鉴定研究

发布时间：2018-02-04 06:05

本文关键词： 二乙烯砜芥子气谷胱甘肽 DNA加合物 HaCaT细胞 SD大鼠　出处：《中国人民解放军军事医学科学院》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：芥子气(英文全称Sulfur mustard简称SM)即二氯二乙基硫醚,是一种典型的糜烂性化学战剂,被禁止化学武器组织(OPCW)严格控制和禁用。由于其制备简单,使用门槛低,难防难治,极易用于战争、恐怖袭击等,对人民的健康安全造成了极大地威胁。SM暴露生物体后,具有广泛的毒性,中毒损伤机制复杂,其具体的毒理作用机制至今还未阐明。目前普遍认为DNA烷基化损伤及断裂是其生物毒性最直接、最重要的始发机制。因此,DNA加合物成为SM中毒后最重要的内暴露指标,是国内外研究SM中毒后体内损伤机制的热点。课题组前期研究结果表明,SM暴露后在体内迅速发生氧化反应,其中大部分(约90%)转化为芥子亚砜(SMO),SMO会逐步氧化成芥子砜(SMO2),SMO2可进一步转化为的二乙烯砜(DVS)。已有报道,DVS属剧毒分子,其毒性高于SM,并且具有类SM的糜烂性和高反应活性。但目前围绕其开展的毒理研究工作较少,有关DVS的DNA损伤效应研究更是尚未见有文献报道。本文以SM的重要氧化代谢产物DVS为研究对象,详细研究其与体内重要活性分子,包括谷胱甘肽(GSH)、嘌呤、核苷和DNA等形成加合物的特性和能力,阐述DVS对机体造成氧化损伤和基因损伤的分子基础,进而揭示其对SM系列损伤效应的贡献,回答SM代谢产物是否具有二次损伤效应的疑问,为溯源芥子气中毒和开展医学干预提供新思路。主要研究内容如下:首先设计和优化合成路线,制备系列新加合物;进而采用HPLC-MS/MS、NMR等技术对其结构进行了鉴定,在此基础上建立有效的LC-MS/MS方法,详细考察DVS及其二相代谢产物形成的DNA加合物在动物体内各组织的分布情况及时效关系,为更准确阐述SM中毒损伤机制提供重要理论依据。具体分为五章:第一章为前言。详细介绍了SM的相关理化性质及其在体内包括氧化水解途径、结合途径在内的多种代谢途径。重点阐述了SM在体内的氧化代谢途径及重要代谢产物DVS的来源及其毒性和损伤机制,明确DVS的毒性高于SM且能诱导产生基因毒性,围绕DVS提出研究目标和研究内容。第二章是参考品制备和鉴定。以SM为起始原料,经过两次“串联氧化”反应和一步“脱氯”反应,方便高效的获得了DVS。在此基础上,通过优化反应底物,简化分离纯化条件,首次制备了5种新的DVS-嘌呤加合物和2种GSH-DVS-嘌呤加合物。并采用HPLC-MS/MS、NMR、HPLC、GC-MS等技术对加合物进行结构确证及纯度分析。第三章为体外DVS反应特性考察及DVS-DNA加合物检测方法建立。在体外溶液中重点考察了DVS与嘌呤碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤)、脱氧核苷(腺苷、鸟苷)、DNA在近生理条件下形成加合物的特性及机理,进而建立有效的DVS-DNA加合物的LC-MS/MS检测方法,完成染毒HaCa T细胞内的DNA加合物的检测。检测结果显示,水体系中DVS能与DNA形成五种加合物,具体是N3-HESVA,N7-HESVG,N3-AHESEHG-N7,N7-GHESEHG-N7,N3-AHESEHA-N3。而染毒细胞内仅检测到四种DNA加合物并非五种,未检测到N3-AHESEHA-N3,从而确证了DVS对DNA存在损伤效应。第四章是DVS染毒动物体内DVS-DNA加合物的确证及组织分布研究。建立了DVS静脉染毒SD大鼠模型,在暴露后不同时间点采集重点脏器组织,如肝、脾、肺、肾、脑等,定量检测DVS-DNA加合物的含量分布,考察DVS损伤水平及毒性特点。结果表明,染毒动物实验结果与细胞实验一致,仅检测到四种DNA加合物。相比于SM,DVS形成加合物的种类和丰度存在显著差异,对脏器的持续损伤能力更强,部分DNA加合物可在体内存在数天,组织分布不显著。第五章进一步研究了DVS二相代谢产物DVS-GSH与DNA加合反应特性。重点考察了DVS与GSH、DVS-GSH与DNA在近生理条件下体外的反应加合情况,结果表明在水溶液中DVS与GSH的反应活性显著高于SM,且生成的DVS-GSH单加合物也具有较高的反应活性,可与DNA的腺嘌呤和鸟嘌呤生成系列新的加合物(GSH-DVS-Ade、GSH-DVS-Gua),且前者加合物的丰度比高于后者,因此DVS的二相代谢产物DVS-GSH对DNA的损伤效应也值得关注。综上所述,本论文完成SM氧化代谢物DVS系列DNA加合物参考品的制备,建立了DVS-DNA加合物的LC-MS/MS方法,完成染毒细胞内DVS-DNA加合物的鉴定及染毒动物体内DVS-DNA加合物的组织分布研究,并初步探讨了DVS的二相代谢产物(DVS-GSH)对DNA的损伤效应。
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【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R82

【参考文献】