提高破伤风类毒素免疫原性的初步研究

发布时间：2016-11-22 18:07

  本文关键词：胃漂浮海藻酸钙缓释微球体内外研究，，由笔耕文化传播整理发布。

《西北农林科技大学》 2006年

提高破伤风类毒素免疫原性的初步研究

蒋会婷  

【摘要】： 破伤风梭菌产生的破伤风毒素,经0.4%甲醛灭活后,失去毒性而仍保留抗原性称之为破伤风类毒素。类毒素精制后,可作为疫苗对人和动物进行免疫接种。但机体感染后不能获得终身免疫力,且此免疫程序较长。为了减轻接种的副反应,提高免疫效果,减少注射次数,提高接种覆盖率,本研究采用原核细胞表达具有高免疫原性的重组C蛋白,用于生产疫苗及免疫接种,以避免出现副作用;另外,用双功能交联剂戊二醛聚合破伤风毒素,使毒素分子之间进行交联,从而产生分子量较大的,表面决定簇多的聚合类毒素。该类毒素作为免疫的抗原,可以诱发较高的抗体水平,加强免疫记忆,延长保护机体免受破伤风的侵害的时间。 1.利用PCR技术从破伤风梭菌基因组DNA中扩增出1 356 bp的破伤风毒素C基因,将该基因片段插入到表达载体pET32a(+)中,转化宿主菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达,观察各种条件下对重组菌蛋白表达的影响。对重组后蛋白用Ni-NAT亲和层析的技术纯化C融合蛋白,然后进行小鼠免疫实验并测定效价。研究显示:经SDS-PAGE分析,重组破伤风毒素C蛋白(rTTC)的表达量占可溶性蛋白的28.19%,纯化后得到蛋白纯度为96.92%。免疫印迹证实该重组蛋白是破伤风毒素C蛋白抗原,对小鼠免疫,三免后14 d rTTC组小鼠抗体效价仍能达到1∶16 000。所获得的重组蛋白具有良好的免疫原性。 2.经过厌氧培养的破伤风梭菌,产毒后进行脱毒、精制,在产毒期间进行毒力鉴定、解毒和毒性逆转实验。再由戊二醛聚合破伤风类毒素,经不同的聚合条件的优化,进行分子量和Lf的测定,然后免疫小鼠和兔子,并测定其免疫效价。培养的毒素可以作为制备类毒素使用,脱毒精制后的类毒素,经毒力鉴定试验、解毒试验和毒性逆转试验检测后均合格。用pH 7.2的PBS稀释类毒素,终浓度为0.1%、0.3%戊二醛置于室温中聚合稀释后的类毒素12 h,聚合类毒素中聚合的类毒素分子量为600 ku,含量占聚合物的43.82%,经ELISA检测抗原性,抗原与阳性血清呈阳性反应。免疫小鼠和兔子,平均效价在1∶2 0 000～1∶3 0 000。所得到的聚合类毒素具有抗原性及免疫原性。 3.最后将聚合类毒素和未聚合类毒素分别与重组抗原联合免疫马匹,未聚合类毒素的平均效价明显低于聚合类毒素组别,说明在联合免疫后,聚合类毒素可以提高马匹的血清效价。

【关键词】：
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：S852.5
【目录】：

摘要4-5

ABSTRACT5-9

文献综述9-17

第一章 破伤风类毒素的研究进展9-17

1.1 破伤风梭菌的生物学特性9

1.2 破伤风毒素的致病机理9-11

1.3 破伤风的危害与防控措施11

1.4 传统破伤风疫苗的研究进展11-12

1.5 类毒素疫苗的应用现状12-17

试验研究17-58

第二章 破伤风毒素C 基因的克隆、表达和纯化17-36

2.1 材料17-19

2.2 方法19-28

2.3 结果28-34

2.4 讨论34-36

第三章 聚合破伤风类毒素的制备及免疫原性的初步研究36-54

3.1 材料36-37

3.2 方法37-45

3.3 结果45-52

3.4 讨论52-54

第四章 重组蛋白与破伤风聚合类毒素联合免疫54-58

4.1 材料54

4.2 方法54-55

4.3 结果55-56

4.4 讨论56-58

结论58-59

参考文献59-64

附录64-65

致谢65-66

个人简历66

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