CYP2B6体外诱导活性评价模型的建立和应用

发布时间：2017-03-18 15:02

  本文关键词：CYP2B6体外诱导活性评价模型的建立和应用，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：CYP2B6是人细胞色素P450(cytochrome P450, CYP)重要亚型之一,主要存在于肝脏中,其平均含量约占总CYP的2%-10%。CYP2B6参与多种内源性以及外源性物质的合成与生物转化,尤其在临床药物,滥用药物和外源性毒物的代谢中发挥重要的作用。CYP2B6具有高的可被诱导性,研究证明CYP2B6的基因表达可以被苯巴比妥类化合物,6-(4-氯苯基)咪唑并[2,1-b][1,3]噻唑-5-甲醛-O-(3,4-二氯苯基)肟(简称CITCO),利福平等化合物诱导。随着研究的深入,人们逐渐认识到CYP2B6,受到核受体(nuclear receptors, NRs)孕烷X受体(PXR)和组成型雄甾烷受体(CAR)的共同调控。CYP2B6酶诱导易使部分药物的药效或毒性改变,甚至导致药物临床合用过程中出现药物-药物相互作用(drug-drug interacti on, DDI),引起临床用药不良反应。因此,建立CYP2B6酶的诱导作用检测筛选模型具有重要意义。本课题成功构建了基于hPXR/CAR3的CYP2B6药物诱导剂的报告基因分析法,并应用该体外筛选体系进行药物体外诱导研究,筛选获得能够通过激活hPXR/CAR途径,具有潜在转录诱导CYP2B6作用的中药提取物和中药活性成分。确证实验中,药物处理过细胞裂解液分别进行CYP2B6的RNA表达量、CYP2B6蛋白表达量和酶催化活力的测定。本课题的研究成果为预测和研究由于CYP2B6诱导引起的药物相互作用提供检测手段和理论依据。 一、人CYP2B6报告基因模型的建立和验证 以人基因组DNA为模板分别扩增得到CYP2B6的远端和近端启动子序列,插入pGL3-promoter报告基因上游,构建pGL3-CYP2B6-Luc报告基因质粒。以人肝cDNA为模板,扩增得到hCAR3的编码序列,插入pcDNA3.1(+)空载体,得到hCAR3重组表达质粒。前期本实验室已经构建了hPXR的表达质粒pcDNA3.1-hPXR。利用脂质体将CYP2B6报告基因质粒、hPXR或CAR3表达质粒以及内参海肾荧光素酶表达质粒pRL-TK瞬时共转染入人肝癌HepG2细胞,以hPXR/CAR3阳性激动剂利福平和CITCO对CYP2B6的诱导倍数作为指标,优化核受体的表达质粒和内参质粒的比例。同时设置对照组,即转染报告基因质粒和核受体表达质粒相应的空载体以考查细胞内源性转录因子的干扰,最终成功构建并验证了基于hPXR/CAR3的人CYP2B6的报告基因体外筛选模型,为后续CYP2B6中药诱导剂的筛选提供了可靠的检测技术。 二、报告基因模型在人CYP2B6的中药活性成分诱导剂筛选中的应用 采用构建的PXR/CAR介导的人CYP2B6报告基因模型,在24孔板上接种适量密度的HepG2细胞,24h后瞬时共转染报告基因质粒,核受体表达质粒及内参质粒6h后,细胞用加药培养基处理48h,测定荧光值。中药提取物和中药活性成分都用DMSO溶解,中药提取物和活性成分储备液的浓度分别为100mg/ml和10mmol/L,用培养基稀释1000倍后作用于细胞,总浓度分别为100和10μmol/L.若药物存在细胞毒性,则相应降低处理细胞时浓度。考察了5种中药提取物和85种中药活性成分通过hPXR和hCAR3途径对CYP2B6的转录调控作用,筛选得到白术和银杏2种中药提取物,黄酮类芹菜素,丹参的活性成分丹参酮ⅡA和隐丹参酮,五味子的活性成分五味子甲素、五味子乙素、五味子醇甲和五味子酯甲,银杏内酯A和银杏内酯B,胡椒碱,钩藤碱,文多灵,蒿甲醚,二氢欧山芹醇当归酸酯,熊果酸,莪术醇,白花前胡素A,白术的活性成分白术内酯Ⅰ和白术内酯Ⅱ这19种中药活性成分可以通过hPXR途径对CYP2B6产生不同程度的诱导作用,其中蒿甲醚和白花前胡素A还可以通过hCAR3途径对CYP2B6产生诱导作用。为进一步探讨药物浓度对诱导作用的影响,考察不同浓度的这些阳性中药活性成分对CYP2B6诱导作用。结果显示这些中药活性成分对CYP2B6的诱导效应呈现出明显的浓度依赖性。 三、确证8种中药活性成分对人CYP2B6的诱导作用 通过分别检测人CYP2B6的基因表达、蛋白表达和酶活性来确证中药活性成分是否能诱导人CYP2B6。采用可以激活hPXR或hCAR3的中药活性成分处理肠癌LS174T细胞72h,提取细胞总RNA并定量逆转录为cDNA,分别设计针对人CYP2B6和内参GAPDH的PCR引物,进行real-time PCR检测人CYP2B6基因表达量变化。裂解LS174T细胞获取总蛋白,用人CYP2B6的特异性抗体进行Western Blot法检测CYP2B6蛋白表达量变化。一相代谢酶CYP2B6催化探针底物安非他酮为羟基安非他酮,我们建立了代谢物羟基安非他酮在细胞破碎液中的LC-MS/MS分析方法,用于测定细胞破碎液体外孵育体系中羟基安非他酮的浓度,检测人CYP2B6酶活性的变化。通过以上实验,确证了二氢欧山芹醇当归酸酯、芹菜素、莪术醇、白花前胡素A、蒿甲醚、丹参酮ⅡA,隐丹参酮和钩藤碱可以诱导人CYP2B6的RNA表达、蛋白表达和酶活性。提示这些中药活性成分很有可能是人CYP2B6的潜在诱导剂,当这些化合物与CYP2B6代谢的药物同时服用时可能会通过诱导CYP2B6而产生药物-药物相互作用。上述实验结果对中药新药研发和临床合理用药具有一定的指导意义。
【关键词】：人CYP2B6 PXR/CAR 诱导作用 报告基因 中药活性成分
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R96
【目录】：

• 致谢4-5
• 摘要5-8
• Abstract8-11
• 缩略词11-13
• 目录13-15
• 前言15-19
• 1. CYP2B6诱导机制和研究意义15-16
• 2. CYP2B6中药诱导剂筛选现状16-17
• 3. 报告基因法体外筛选模型17-18
• 4. 本研究的目的和方案18-19
• 第1章 hCAR3表达质粒和CYP2B6报告基因质粒的构建19-31
• 1. 引言19
• 2. 实验仪器与材料19-21
• 3. 实验方法21-26
• 4. 实验结果26-28
• 5. 讨论28-29
• 6. 结论29-31
• 第2章 hPXR/CAR介导的CYP2B6的报告基因模型构建31-39
• 1. 引言31
• 2. 实验仪器与材料31-33
• 3. 实验方法33-35
• 4. 实验结果35-37
• 5. 讨论37-38
• 6. 结论38-39
• 第3章 基于hPXR/CAR配体的CYP2B6中药诱导剂筛选39-57
• 1. 引言39
• 2. 实验仪器与材料39-41
• 3. 实验方法41-46
• 4. 实验结果46-54
• 5. 讨论54-56
• 6. 结论56-57
• 第4章 CYP2B6中药诱导剂的确证57-78
• 1. 引言57
• 2. 实验仪器与材料57-60
• 3. 实验方法60-67
• 4. 实验结果67-75
• 5. 讨论75-77
• 6. 结论77-78
• 本研究的总结与主要创新性78-79
• 参考文献79-83
• 综述83-95
• 参考文献90-95
• 作者简介95
• 在读期间获得的奖项95
• 在读期间发表的论文95

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前6条

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  本文关键词：CYP2B6体外诱导活性评价模型的建立和应用，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：254591