壳聚糖为骨架的幽门螺杆菌靶向纳米粒的构建及其体内外活性研究

发布时间：2017-04-09 10:12

  本文关键词：壳聚糖为骨架的幽门螺杆菌靶向纳米粒的构建及其体内外活性研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景:幽门螺杆菌感染是导致胃炎、消化性溃疡的主要诱因。另外,胃癌的发生也与其密切相关。目前针对幽门螺杆菌的药物治疗主要采用三联疗法。然而普通制剂存在药物易被胃酸破坏、胃内药物浓度低,特异性差等缺陷,限制了其进一步的临床应用。口服胃滞留纳米递药系统可以有效降低胃酸对药物的破坏,延长药物在胃内的滞留时间,从而可一定程度增加药物的治疗效果,但现有包载抗菌药物的纳米递药系统在清除幽门螺杆菌方面仍存在靶向性和可控性差等不足,难以满足临床用药的实际要求。研究目的:本论文综合考虑天然高分子材料壳聚糖的生物相容性、黏附性、易于修饰等特点,通过对其骨架中两个位点的修饰,首次以幽门螺杆菌尿素通道蛋白转运体(Ure I)为靶标,引入含不同长度脂肪链的脲基靶向头部,设计合成了两个系列共6种酰胺键连接或酯键连接的壳聚糖衍生物UACs-1/2/3和UECs-1/2/3,希望通过体内外活性评价,得到生物相容性好、具有p H敏感特性的幽门螺杆菌靶向载体材料,为幽门螺杆菌的治疗提供安全有效的递药系统。方法:1.分别以氨基乙酸、6-氨基己酸或12-氨基十二酸为原料,通过与尿素反应得到具有脲基头部的中间体化合物U1/2/3。以壳聚糖为骨架,以2位氨基或6位羟基与上述中间体进行缩合反应,得到酰胺键连接的壳聚糖衍生物UACs-1/2/3和酯键连接的壳聚糖衍生物UECs-1/2/3。通过质谱、核磁、红外等方法对合成的衍生物进行结构鉴定;并通过核磁氢谱计算脂肪链连接的脲基基团的取代度。2.采用离子凝胶法,以三聚磷酸钠(TPP)为交联剂制备壳聚糖衍生物/TPP纳米粒,对影响纳米粒理化性质的壳聚糖衍生物/TPP质量比和壳聚糖衍生物的浓度进行处方优化,并对不同p H环境下的纳米粒的粒径、表面电荷和形态学予以考察。采用XPS能谱分析观察壳聚糖衍生物/TPP纳米粒的表面元素分布情况;利用MTT法考察壳聚糖衍生物/TPP纳米粒的安全性。以阿莫西林(Amoxicillin,AMX)为模型药物,选取最优处方制备阿莫西林-壳聚糖衍生物/TPP纳米粒,对载药纳米粒的载药率和包封率进行表征,并考察其不同p H环境下的释药特性。3.采用比浊度法对阿莫西林-壳聚糖衍生物/TPP纳米粒的体外抗幽门螺杆菌活性进行评价,并考察尿素通道蛋白转运体竞争性底物尿素的加入对载药纳米粒抗幽门螺杆菌活性的影响。采用流式细胞术或共聚焦激光扫描显微镜研究幽门螺杆菌对FITC-UECs-3/TPP纳米粒的摄取及不同p H环境、尿素加入和温度对纳米粒摄取的影响。通过Balb/C小鼠体内幽门螺杆菌生长抑制实验、HE染色等方法评价AMX-UECs-3/TPP纳米粒的体内抗菌活性。利用活体成像仪观察IR783-UECs-3/TPP纳米粒口服后的裸鼠胃肠道分布特性。结果:1.设计合成了两系列共6种壳聚糖衍生物载体材料UACs-1/2/3和UECs-1/2/3,经1H NMR,FTIR等图谱鉴定,所得载体材料与目标物的结构一致,6种壳聚糖衍生物的脲基脂肪链取代度分别为UACs-1(6.56%±0.60%)、UACs-2(3.92%±0.47%)、UACs-3(2.69%±0.31%)、UECs-1(6.81%±0.62%)、UECs-2(5.53%±0.56%)和UECs-3(2.92%±0.47%)。2.经激光粒度及Zeta电位分析仪测定,所制备壳聚糖衍生物/TPP纳米粒在壳聚糖衍生物/TPP质量比为3:1和壳聚糖衍生物浓度为1.8 mg/m L时得到优化处方,粒径范围为123.2 nm-268.6 nm,并且均携带正电荷(18.07 m V-30.53 m V)。XPS能谱分析结果表明,脂肪链连接的脲基头部位于纳米粒的表面。MTT实验结果证实,壳聚糖衍生物/TPP纳米粒细胞毒性小,生物相容性和安全性好。阿莫西林-壳聚糖衍生物/TPP纳米粒载药率在21.7%-28.7%范围内。不同p H环境下的释药结果表明,载药纳米粒在胃内容物酸性条件下释药缓慢,能够保护药物免受胃酸破坏,在p H 7.0时可快速释放药物,该结果与不同p H环境下UECs-3/TPP纳米粒的粒径及形态学变化共同证实了壳聚糖衍生物/TPP纳米粒具有p H敏感特性。3.体外抗菌实验结果表明,与未修饰的AMX-Cs/TPP纳米粒相比,脲基修饰的AMX-UACs-3/TPP纳米粒和AMX-UECs-3/TPP纳米粒展示出更优的体外抗菌活性。并且,加入不同浓度的尿素通道蛋白转运体竞争性底物尿素可明显抑制阿莫西林-壳聚糖衍生物/TPP纳米粒的抗菌活性。细菌摄取实验结果表明,改变细菌所处的p H环境(从p H 7.4到4.0),由于Ure I通道逐渐开放,幽门螺杆菌对FITC-UACs-3/TPP纳米粒的摄取明显增加(平均荧光强度MFI值从51.6增大到114.3)。尿素的加入可竞争性抑制FITC-UECs-3/TPP纳米粒的摄取入胞(MFI值分别从114.3降低至91.8(p H 4.0)和91.7降低至76.1(p H 5.5))。随着温度的降低(37℃到4℃)FITC-UACs-3/TPP纳米粒的摄取也显著减少,这与降低Ure I通道的活性,继而阻碍幽门螺杆菌对FITC-UACs-3/TPP纳米粒的摄取有关。体内抗菌实验结果表明,与阿莫西林游离药物组和未修饰的AMX-Cs/TPP纳米粒组相比,AMX-UECs-3/TPP纳米粒展示出更好的体内抗菌活性(p0.05)。HE染色实验证实,与阿莫西林游离药物和未修饰的AMX-Cs/TPP纳米粒相比,脲基修饰AMX-UECs-3/TPP纳米粒能够很好地降低幽门螺杆菌引起的小鼠胃黏膜的损伤和炎症反应。通过裸鼠活体成像实验发现,IR783-UECs-3/TPP纳米粒给药6 h后仍可大部分滞留在胃内,为体内靶向递药和幽门螺杆菌的有效治疗奠定了基础。结论:本论文以幽门螺杆菌尿素通道蛋白转运体为靶标,在壳聚糖骨架材料中引入不同长度饱和脂肪链连接的脲基靶向头部,构建了两个系列共6种幽门螺杆菌靶向载体材料及其载药纳米粒,并对其体内和体外抗菌活性及其靶向特性进行了研究。研究结果显示,上述壳聚糖衍生物制备的纳米粒具有良好的生物相容性、p H敏感特性和幽门螺杆菌靶向性,优选的AMX-UECs-3/TPP纳米粒在体内外均显示良好的抗幽门螺杆菌活性。通过进一步的成药性研究,可望为幽门螺杆菌的靶向治疗奠定基础,具有重要的理论和实际应用价值。
【关键词】：幽门螺杆菌 壳聚糖 纳米递药系统 脲基 pH敏感性 靶向治疗 尿素通道蛋白转运体
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R943;R96
【目录】：

• 缩略语表6-8
• 中文摘要8-12
• 英文摘要12-16
• 前言16-18
• 文献回顾18-31
• 第一部分 壳聚糖衍生物载体材料的设计合成及其结构表征31-39
• 1 材料33-34
• 1.1 仪器33
• 1.2 试剂33-34
• 2 方法34-38
• 2.1 中间化合物U2和U3的合成34-35
• 2.2 壳聚糖衍生物载体材料UACs-1/2/3 的合成35-36
• 2.3 壳聚糖衍生物载体材料UECs-1/2/3 的合成36-38
• 3 结果与讨论38-39
• 第二部分 阿莫西林-壳聚糖衍生物/TPP纳米粒的制备和表征39-51
• 1 材料39-40
• 1.1 仪器39
• 1.2 试剂39-40
• 1.3 细胞40
• 2 方法40-43
• 2.1 壳聚糖衍生物/TPP纳米粒制备方法的处方优化40-41
• 2.2 壳聚糖衍生物/TPP纳米粒的表征41-42
• 2.3 阿莫西林-壳聚糖衍生物/TPP纳米粒的制备及表征42-43
• 2.4 体外释药实验43
• 3 结果与讨论43-51
• 3.1 壳聚糖衍生物/TPP纳米粒的处方优化43-45
• 3.2 壳聚糖衍生物/TPP纳米粒的表征45-48
• 3.3 AMX-UACs/TPP纳米粒和AMX-UECs/TPP纳米粒的制备及表征48-49
• 3.4 体外释药实验49-51
• 第三部分 阿莫西林-壳聚糖衍生物/TPP纳米粒的体外活性研究51-64
• 1 材料51-52
• 1.1 仪器51
• 1.2 试剂51-52
• 2 方法52-55
• 2.1 细菌培养52
• 2.2 载药纳米粒的体外幽门螺杆菌生长抑制实验52-53
• 2.3 尿素对载药纳米粒抗幽门螺杆菌活性的影响53
• 2.4 FITC-UECs-3/TPP纳米粒的幽门螺杆菌摄取研究53-55
• 3 结果与讨论55-64
• 3.1 载药纳米粒的体外幽门螺杆菌生长抑制实验55-57
• 3.2 尿素对载药纳米粒抗幽门螺杆菌活性的影响57-58
• 3.3 FITC-UECs-3/TPP纳米粒的幽门螺杆菌摄取研究58-64
• 第四部分 阿莫西林-壳聚糖衍生物/TPP纳米粒的体内活性研究64-71
• 1 材料64
• 1.1 仪器64
• 1.2 试剂64
• 1.3 动物64
• 2 方法64-66
• 2.1 体内抗幽门螺杆菌活性研究64-65
• 2.2 IR783-UECs-3/TPP纳米粒的胃肠道分布65-66
• 3 结果与讨论66-71
• 3.1 体内抗幽门螺杆菌实验结果66-69
• 3.2 IR783-UECs-3/TPP纳米粒的裸鼠胃肠道分布69-71
• 小结71-72
• 参考文献72-82
• 附录82-93
• 个人简历和研究成果93-94
• 致谢94

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