三氯生通过诱导自噬加强巨噬细胞清除胞内寄生菌机制研究

发布时间：2017-04-20 17:25

  本文关键词：三氯生通过诱导自噬加强巨噬细胞清除胞内寄生菌机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：自噬是真核生物进化中高度保守的细胞内过程,其功能是降解和回收细胞内大分子物质和受损细胞器。自噬不仅能以非选择性的方式降解底物,还能以选择性的方式清除细胞内的物质。因此,选择性自噬在对抗病原微生物的过程中扮演了重要的角色,是宿主细胞重要的免疫应答反应。这个既保守又复杂的过程需要完善的调控机制来支撑,已有超过36种自噬相关基因(Autophagy-related gene,ATG)在酵母细胞中被发现,其表达的蛋白常常以形成复合物的形式参与自噬过程的调控,此外,越来越多的自噬通路正在被人们所发现。三氯生是一种广谱抗菌剂,具有抗大多数革兰氏阳性菌、革兰氏阴性无芽孢菌、一些真菌、疟原虫和弓形虫的作用。至今,已经揭示的三氯生抗菌机制为“其通过抑制病原菌脂肪酸合成过程中起关键作用的脂肪酸合成酶II型(FAS II)的活性达到抗菌效果”。三氯生通过该作用机制不易使病原菌产生耐药性,因此被添加在多种消毒剂和洗护用品中,并且目前已有三氯生成功治疗小鼠系统性细菌感染的研究报道。基于上述三氯生抗菌的广谱性和自噬在抗病原微生物中的作用,在本研究中,我们以巨噬细胞RAW264.7为模式细胞,结合体内实验,探究三氯生能否通过诱导自噬加强巨噬细胞清除胞内寄生菌,并考察其作用机制。首先,我们利用荧光显微镜对经三氯生作用的He La细胞表达GFP-LC3的水平进行观察;利用透射电镜对三氯生作用的RAW264.7细胞中的自噬体进行观察;利用western blot技术对RAW264.7细胞的LC3表达水平进行检测;利用western blot技术对三氯生作用的小鼠肝脏、脾脏内LC3表达水平进行检测;对He La细胞GFP-LC3、RFP-LC3的表达情况进行荧光显微镜观察;对三氯生和氯喹(CQ)处理的RAW264.7细胞中LC3表达水平进行比较。结果表明:三氯生可诱导He La细胞中GFP-LC3斑点增多以及RAW264.7细胞中自噬体增加;三氯生诱导RAW264.7细胞、小鼠肝脏、小鼠脾脏中LC3-II/LC3-I的值增加;三氯生诱导He La细胞中GFP-LC3、RFP-LC3斑点增多,且后者多于前者;三氯生作用过程中的LC3降解过程能被CQ抑制。其次,我们利用western blot技术分别检测了不同浓度三氯生作用不同时间的RAW264.7细胞内m TOR、p70S6K、4E-BP1、AMPK-α、AMPK-β、ULK1、ERK、JNK、p38蛋白的磷酸化水平;利用western blot技术分别检测抑制剂PD98059、SB203580、SP600125预处理三氯生作用细胞的ERK、JNK、p38蛋白的磷酸化水平以及LC3的表达水平。结果表明:三氯生不能抑制m TOR、p70S6K、4E-BP1的磷酸化;三氯生能诱导AMPK-α、AMPK-β、ULK1、ERK、JNK、p38的磷酸化;SP600125可抑制三氯生诱导的ERK、JNK、p38的磷酸化,SB203580可抑制三氯生诱导的ERK、p38的磷酸化,PD98059可抑制三氯生诱导的ERK的磷酸化。最后,我们利用激光共聚焦显微镜观察沙门氏菌、白色念珠菌及其分别加入三氯生之后作用于RAW264.7细胞的p62、NDP52、LC3蛋白的表达水平和共定位水平;利用菌落计数对三氯生是否体外能加强RAW264.7细胞吞噬、杀伤能力进行评价;利用菌落计数对三氯生是否能体内加强小鼠沙门氏菌感染模型和白色念珠菌感染模型中杀菌能力进行评价。结果表明:三氯生能诱导p62、NDP52的表达以及能加强p62、NDP52与菌的共定位;三氯生体外能够加强RAW264.7细胞对沙门氏菌、白色念珠菌的吞噬和清除;三氯生体内能够加强小鼠沙门氏菌感染模型和白色念珠菌感染模型中对病原菌的清除。总之,本研究结果表明,三氯生能通过激活AMPK/ULK1和JNK/ERK/p38途径的磷酸化而非抑制m TOR途径的磷酸化诱导自噬的发生,并且通过这一作用机制加强了巨噬细胞对胞内菌的清除。本研究丰富了三氯生的抗菌机制,为以三氯生为先导化合物的抗系统性细菌感染药物开发及以自噬为药靶的抗菌新药发现打下实验基础。
【关键词】：三氯生 巨噬细胞 自噬 杀菌 机制
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R96
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 英文缩写词表11-12
• 引言12-13
• 第一篇 文献综述13-31
• 第一章 三氯生的药理作用及应用研究进展13-18
• 1.1 三氯生概述13-14
• 1.2 三氯生的抗菌机制14-16
• 1.3 三氯生的应用16-18
• 第二章 细胞自噬研究进展18-29
• 2.1 概述18
• 2.2 自噬的分类18-21
• 2.3 自噬的发生过程21-22
• 2.4 自噬的通路及调控22-26
• 2.5 自噬的生物学作用26-29
• 第三章 巨噬细胞研究进展29-31
• 3.1 巨噬细胞概述29
• 3.2 巨噬细胞抗菌机制29-31
• 第二篇 研究内容31-65
• 第一章 三氯生诱导巨噬细胞自噬31-46
• 1.1 实验材料31-33
• 1.2 实验方法33-38
• 1.3 实验结果38-43
• 1.4 讨论43-45
• 1.5 小结45-46
• 第二章 三氯生诱导巨噬细胞自噬的机制研究46-54
• 2.1 实验材料46-47
• 2.2 实验方法47
• 2.3 实验结果47-51
• 2.4 讨论51-53
• 2.5 小结53-54
• 第三章 三氯生通过诱导自噬加强巨噬细胞胞内菌清除54-65
• 3.1 实验材料54-55
• 3.2 实验方法55-58
• 3.3 实验结果58-63
• 3.4 讨论63-64
• 3.5 小结64-65
• 结论65-66
• 参考文献66-75
• 导师简介75-76
• 作者简介及在学期间所取得的科研成果76-77
• 致谢77

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  本文关键词：三氯生通过诱导自噬加强巨噬细胞清除胞内寄生菌机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：319186