辛伐他汀对小鼠脂肪细胞糖代谢的影响及其机制的研究

发布时间：2017-04-29 05:08

  本文关键词：辛伐他汀对小鼠脂肪细胞糖代谢的影响及其机制的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：【研究背景】他汀类药物(3-hydroxy-3-methyl-glut-aryl CoA reeducates inhibitor,HMG CoA还原酶抑制剂)是动脉粥样硬化性心血管疾病一级预防和二级预防的基石。他汀通过抑制胆固醇合成的限速酶——HMG CoA还原酶——降低患者血浆低密度脂蛋白胆固醇(Low Density Lipoprotein-Cholesterol,LDL-C)浓度,有效延缓和抑制动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)的发生发展,已被确立为调脂治疗及抗动脉粥样硬化治疗的首选药物之一。但近年来研究显示,某些他汀类药物对糖代谢具有潜在的不利影响,但机制不清。【目的】观察亲脂性的他汀(辛伐他汀)对分化成熟的3T3-L1脂肪细胞糖代谢的影响并探讨其可能的机制。【方法】1、采用经典的激素“鸡尾酒”(诱导培养基A:胰岛素5 mg/L,地塞米松1.0μmol/L,3-异丁基-1-甲基-黄嘌呤5 mmol/L;诱导培养基B:胰岛素10mg/L)诱导方法,诱导3T3-L1前脂肪细胞为成熟的脂肪细胞,显微镜下观察3T3-L1前脂肪细胞及脂肪细胞形态,油红“O”染色观察细胞内脂滴聚集。2、将诱导成熟的3T3-L1脂肪细胞随机分为NC组(对照组)、A组、B组和C组,分别用含0、2、5、10μmol/L辛伐他汀浓度及10 nmol/L胰岛素的完全培养基培养48小时。3、CCK-8试剂盒分析不同浓度辛伐他汀对3T3-L1脂肪细胞活性的影响。4、采用葡萄糖氧化酶法检测并计算各组的葡萄糖消耗量。5、运用荧光定量PCR(Real-Time PCR)检测IR,GLUT-4及PPAR-γmRNA的表达水平。6、Western blot检测P-PI3K,P-Akt,总GLUT-4及膜GLUT-4蛋白表达水平。7、流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞周期及细胞膜上胰岛素受体IR、膜蛋白GLUT-4的表达水平。【结果】1、显微镜下观察3T3-L1前脂肪细胞呈成纤维细胞样的长梭形,胞浆中无脂滴;分化成熟后,细胞呈大圆形,胞浆内可见大量脂滴包绕胞核,呈“戒环”状。2、不同浓度辛伐他汀(实验浓度:0、2、5、10μmol/L)作用于分化成熟的3T3-L1脂肪细胞,对细胞活性没有明显影响(p0.05),而当浓度过高时(辛伐他汀:15、20μmol/L),明显影响细胞活性(p0.05)。3、不同浓度辛伐他汀(实验浓度:0、2、5、10μmol/L)作用于分化成熟的3T3-L1脂肪细胞,葡萄糖消耗量呈浓度依赖性减少,并且在较高浓度时(辛伐他汀:10、20μmol/L),明显减少,并且有统计学意义(p0.05)。4、不同浓度辛伐他汀(0、2、5、10μmol/L)作用于分化成熟的3T3-L1脂肪细胞,P-Akt表达水平在高浓度(10μmol/L)时明显下降(p0.05),膜GLUT-4蛋白表达水平在中高浓度(5、10μmol/L)时明显下降(p0.05),P-PI3K、总GLUT-4蛋白表达量无明显减少(p0.05)。5、不同浓度辛伐他汀(0、2、5、10μmol/L)作用于分化成熟的3T3-L1脂肪细胞,IR m RNA水平在中高浓度(5、10μmol/L)时,表达明显减少(p0.05);PPAR-γm RNA水平在高浓度(10μmol/L)时,表达明显减少(p0.05);GLUT-4 m RNA水平无明显变化(p0.05)。6、流式细胞术试验表明中高浓度辛伐他汀对细胞凋亡率和细胞周期及细胞膜IR蛋白的表达无明显的影响,而GLUT-4蛋白在高浓度时,表达水平明显降低(p0.05)。【结论】本研究表明辛伐他汀可能通过抑制Ins/IR/IRS-1/PI3-K/AKT/GLUT-4信号通路和PPARγ/GLUT-4信号通路,从而抑制GLUT-4由胞浆向胞膜的转移,进而抑制葡萄糖由胞外向胞内的转运。
【关键词】：辛伐他汀 新发糖尿病 脂肪细胞 糖代谢 胰岛素抵抗
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R965
【目录】：

• 英文缩略词表5-6
• 中文摘要6-8
• Abstract8-11
• 第一章 前言11-13
• 第二章 材料和方法13-31
• 2.1 材料13-18
• 2.1.1 实验细胞株13
• 2.1.2 主要试剂及来源13
• 2.1.3 相关试剂配制13-17
• 2.1.4 主要仪器设备17-18
• 2.2 实验方法18-21
• 2.2.1 3T3-L1细胞株的培养、传代18
• 2.2.2 3T3-L1细胞的诱导分化18-19
• 2.2.3 3T3-L1细胞的冻存（冻存原则：缓慢降温）19
• 2.2.4 3T3-L1细胞的复苏（复苏原则：快速复温）19
• 2.2.5 分化成熟的 3T3-L1细胞的鉴定19-20
• 2.2.6 分化成熟 3T3-L1细胞的分组处理20-21
• 2.3 CCK-8 试剂盒检测辛伐他汀对 3T3-L1脂肪细胞活性的影响21
• 2.3.1 3T3-L1脂肪细胞的铺板及处理21
• 2.3.2 CCK-8 试剂的处理及吸光度值（OD值）的测定21
• 2.4 葡萄糖氧化酶法测定各处理组的葡萄糖浓度，计算各组葡萄糖消耗量21-22
• 2.5 实时荧光定量PCR方法检测辛伐他汀作用下 3T3-L1脂肪细胞GLUT-4 mRNA、PPAR-γ mRNA及IR mRNA的表达水平22-25
• 2.5.1 TRizol法提取 3T3-L1脂肪细胞的总RNA22-23
• 2.5.2 逆转录PCR（reverse transcription PCR,RT-PCR）23-24
• 2.5.3 Real-Time PCR24-25
• 2.6 免疫印迹法（Western blot）检测细胞总蛋白GLUT-4、膜蛋白GLUT-4、P-PI3K及P-Akt蛋白的表达水平25-28
• 2.6.1 细胞总蛋白的提取25
• 2.6.2 蛋白浓度的测定：BCA法测蛋白浓度25-26
• 2.6.3 细胞蛋白样品的制备26
• 2.6.4 Western blot检测蛋白基本步骤26-28
• 2.7 流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞周期，，检测细胞膜IR、GLUT-4 蛋白的表达28-31
• 2.7.1 利用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡28-29
• 2.7.2 利用流式细胞抗体检测细胞膜表面蛋白的变化29-31
• 第三章 结果31-38
• 3.1 3T3-L1前脂肪细胞诱导前、诱导第4天及诱导第9天后的形态31
• 3.2 CCK-8 检测药物对细胞活性的影响31-32
• 3.3 葡萄糖氧化酶法检测不同药物浓度下葡萄的消耗量32-33
• 3.4 Real Time PCR检测 3T3-L1脂肪细胞GLUT-4 mRNA、PPAR-γ mRNA及IR mRNA的表达水平33-35
• 3.4.1 GLUT-4 mRNA表达33
• 3.4.2 PPAR-γ mRNA表达33-34
• 3.4.3 IR mRNA表达34-35
• 3.5 Western blot检测P-PI3K，P-Akt，总GLUT-4 及膜GLUT-4 蛋白表达水平35-36
• 3.6 流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞周期及膜IR蛋白及GLUT-4 蛋白表达水平36-38
• 第四章 讨论38-42
• 第五章 结论42-43
• 参考文献43-45
• 致谢45-46
• 综述46-55
• 综述参考文献53-55

【共引文献】

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本文编号：334257