血清中蓖麻毒素的生物质谱分析方法的建立

发布时间：2017-04-30 11:14

  本文关键词：血清中蓖麻毒素的生物质谱分析方法的建立，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：蓖麻毒素是从大戟科蓖麻属植物蓖麻种子中分离得到的一种异源二聚体的糖蛋白，分子量约为65KDa，由A链和B链组成，两条多肽链通过链间二硫键相连。A链作为蓖麻毒素的活性链，可使核糖体失活，抑制蛋白质合成；B链是蓖麻毒素的结合链，含有两个半乳糖残基结合位点，能够与细胞表面上含有半乳糖的糖蛋白或糖脂结合，介导毒素分子以细胞内吞的方式进入细胞内，从而引发毒性作用。蓖麻毒素在肿瘤治疗、生物农药等方面均有应用，由于蓖麻毒素进入细胞后，可在短时间内阻止细胞蛋白质合成导致细胞死亡，这种极强的毒性作用使其在生物安全、食品安全等方面存在着极大的隐患，一度被美国疾病控制和预防中心认定为一种生物武器。因此，对该潜在生物战剂检测方法的研究从未间断。 随着科学技术的发展，蓖麻毒素的检测方法呈现出多样性。目前研究较多的是基于抗体的免疫学分析方法，由于涉及抗体，其经济成本很高，并且分析过程较为复杂，耗时，通常分析一例样本需要7小时左右。因此亟需开发一种简便易行的蓖麻毒素快速分析方法。电喷雾电离和基质辅助激光解吸电离的出现使得对过去难以检测的蛋白质、多肽和核酸等生物大分子的检测成为可能。同时它们所具有的高灵敏度和高质量检测范围，使得质谱技术在生命科学领域获得了广泛应用和发展。磁珠技术是一种用于物质分离与纯化的新技术，根据研究物质的不同可在其表面包被不同的化学基团，再根据其磁性分离的特性对复杂环境中的样品进行分离和富集。本实验室已成功合成铜螯合纳米磁珠，将其应用于血清中多肽的富集和纯化，通过与质谱联合应用可判断急性白血病疗效、诊断卵巢癌等，并成功建立了铜螯合纳米磁珠结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱对血清中的多肽类毒素-芋螺毒素的分析方法。基于上述研究基础，，本论文提出建立血清中大分子蛋白类毒素-蓖麻毒素的铜螯合纳米磁珠结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱快速分析方法。 应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测蓖麻毒素样品完整分子量，获得[M+H]+峰，m/z63528Da。应用变性剂将蓖麻毒素的A链和B链二硫键还原，再通过凝胶电泳技术分离，将A链及B链对应的条带进行胶内胰蛋白水解酶酶切，利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱获得肽质量指纹图谱。再应用胰蛋白水解酶和糜蛋白水解酶分别对蓖麻毒素进行溶液酶切，应用超高效液相-电喷雾质谱技术分析其特征肽段及肽序列信息，胰蛋白酶酶切后蛋白序列覆盖率为61%，糜蛋白酶酶切后蛋白序列覆盖率为42%，综合覆盖率82%。通过对蓖麻毒素A链含有活性位点肽段和蓖麻毒素B链蛋白C端肽段的序列分析，可明确该蓖麻毒素样品的结构信息，为后续铜螯合纳米磁珠提取蓖麻毒素标志肽段的选取提供依据。 为了进一步改进实验进程，我们应用蛋白酶解变性剂RapiGest辅助胰酶酶切并摸索了酶切方法，将酶切时间从12小时缩短至3个小时，大大提高了实验效率。为排除血清中本底水平的肽段对蓖麻毒素特征肽段的干扰，通过对磁珠提取血清肽段进行质谱分析比对，排除血清肽段谱峰干扰，选取了[M+H]+为1728.8Da的肽段作为蓖麻毒素的特征性肽段用于鉴定。进一步应用超高效液相-电喷雾质谱确定了[M+H]+为1728.8Da肽段序列SAPDPSVITLENSWGR。应用上述建立的方法重复6次实验，方法重复性良好，统计分析的结果m/z平均值为1728.94Da，CV为0.0016%，信噪比平均值为11.76，CV为16.10%。通过对铜螯合纳米磁珠结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱快速分析血清中蓖麻毒素的检测限研究，水溶液中蓖麻毒素的检测限为2ng/μl，血清中的检测限为5ng/μl。并经过试验证实，该方法也可以应用于破伤风素的鉴定。 本研究工作建立了一种铜纳米螯合磁珠结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测血清中蓖麻毒素的方法，其原理是利用蛋白质或多肽表面的组氨酸、半胱氨酸、色氨酸等与金属离子产生配位结合，由于蛋白质或多肽表面氨基酸的组成、位置和空间构象不同，因此与金属螯合物的亲和力强弱也不同，从而选择性地对其分离纯化。该方法快速，简便易行，且重复性良好。为蛋白质类毒素的检测提出了新的鉴定思路。为毒素分析领域向高通量、高灵敏度方向发展奠定了良好的基础。
【关键词】：铜螯合纳米磁珠 生物质谱 蓖麻毒素 检测 血清
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R99
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-14
• 英文缩写表14-15
• 第一章 绪论15-28
• 1.1 蓖麻毒素研究背景15-22
• 1.1.1 蓖麻毒素的理化性质与结构15-16
• 1.1.2 蓖麻毒素的危害与毒性作用16-18
• 1.1.3 蓖麻毒素的应用18-20
• 1.1.4 蓖麻毒素的检测20-22
• 1.2 生物质谱技术22-26
• 1.2.1 电喷雾质谱22-23
• 1.2.2 基质辅助激光解吸质谱23
• 1.2.3 生物质谱技术在蛋白质分析中的应用23-26
• 1.3 金属螯合纳米磁珠提取技术26-27
• 1.3.1 金属螯合纳米磁珠提取技术原理26-27
• 1.3.2 金属螯合纳米磁珠提取技术的应用27
• 1.4 本论文研究内容27-28
• 第二章 蓖麻毒素结构确证28-44
• 2.1 材料28-31
• 2.1.1 试剂28-29
• 2.1.2 溶液配制29-30
• 2.1.3 仪器30-31
• 2.1.4 分析软件31
• 2.2 实验方法31-34
• 2.2.1 蓖麻毒素蛋白定量31
• 2.2.2 蓖麻毒素完整分子量测定31
• 2.2.3 MALDI-TOF-MS 检测蓖麻毒素 A 链、B 链肽指纹谱31-33
• 2.2.3.1 SDS-PAGE 法分离 A 链、B 链31-32
• 2.2.3.2 胶内酶切32
• 2.2.3.3 酶切后肽段提取32
• 2.2.3.4 样品脱盐32-33
• 2.2.3.5 A 链、B 链肽指纹谱检测33
• 2.2.4 UPLC-MS/MS 检测蓖麻毒素溶液酶切后肽段33-34
• 2.2.4.1 蓖麻毒素溶液酶切33
• 2.2.4.2 样品制备33
• 2.2.4.3 液相色谱分离条件33-34
• 2.2.4.4 四级杆-飞行时间串联质谱参数设置34
• 2.2.5 数据分析34
• 2.3 实验结果34-43
• 2.3.1 蓖麻毒素定量结果34-35
• 2.3.2 蓖麻毒素的完整分子量35
• 2.3.3 SDS-PAGE 分离蓖麻毒素结果35-36
• 2.3.4 MALDI-TOF-MS 检测蓖麻毒素 A 链、B 链肽指纹图结果36-37
• 2.3.5 nanoUPLC-ESI-TOF-MS/MS 检测酶酶切蓖麻毒素肽段结果37-43
• 2.3.5.1 蓖麻毒素酶切总离子流图37-38
• 2.3.5.2 蓖麻毒素理论序列38-39
• 2.3.5.3 检测酶切蓖麻毒素肽段覆盖率39-42
• 2.3.5.4 蓖麻毒素重要特征肽段序列分析检测42-43
• 2.4 小结43-44
• 第三章 铜螯合纳米磁珠结合 MALDI-TOF MS 质谱分析鉴定血清中蓖麻毒素44-62
• 3.1 材料45-46
• 3.1.1 试剂45
• 3.1.2 溶液配制45-46
• 3.1.3 仪器46
• 3.1.4 分析软件46
• 3.2 实验方法46-49
• 3.2.1 蛋白酶解变性剂对酶解效率的影响46
• 3.2.2 蓖麻毒素快速酶切46-47
• 3.2.3 铜螯合纳米磁珠提取蓖麻毒素酶切溶液47
• 3.2.4 铜螯合纳米磁珠提取酶切蓖麻毒素溶液质谱检测47
• 3.2.5 血清蛋白质快速酶切47-48
• 3.2.6 铜螯合纳米磁珠提取血清蛋白酶切溶液48
• 3.2.7 铜螯合纳米磁珠提取血清蛋白酶切溶液质谱检测48
• 3.2.8 重复性试验48
• 3.2.9 铜螯合纳米磁珠提取蓖麻毒素酶切后特征肽段灵敏度48
• 3.2.10 磁珠提取结合 MALDI-TOF-MS 方法蓖麻毒素检出限48
• 3.2.11 磁珠提取结合 MALDI-TOF-MS 方法在破伤风毒素检测中的应用48-49
• 3.3 实验结果49-60
• 3.3.1 蛋白酶解变性剂对酶解效率的影响49-50
• 3.3.2 铜螯合纳米磁珠提取蓖麻毒素特征肽段结果50-52
• 3.3.3 铜螯合纳米磁珠提取血清酶切肽段结果52-54
• 3.3.4 蓖麻毒素特征肽段挑选54-56
• 3.3.5 铜螯合纳米磁珠富集标志肽段结果56
• 3.3.6 方法重复性56-57
• 3.3.7 铜螯合纳米磁珠结合 MALDI-TOF-MS 法分析水溶液中蓖麻毒素检测限57-58
• 3.3.8 铜螯合纳米磁珠结合 MALDI-TOF MS 法分析血清中蓖麻毒素的检测限58-59
• 3.3.9 磁珠结合 MALDI-TOF-MS 方法在破伤风毒素检测中的应用59-60
• 3.4 小结60-62
• 第四章 结论62-64
• 参考文献64-75
• 作者简介及在学期间所获科研成果75-76
• 致谢76

【参考文献】

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本文编号：336764