α-倒捻子素衍生物对神经干细胞分化的影响及其机制研究

发布时间：2017-05-10 14:05

  本文关键词：α-倒捻子素衍生物对神经干细胞分化的影响及其机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景:在传统观念中,成年哺乳动物的中枢神经系统是不可再生的,一旦出现神经元的损伤或者丢失将难以修复,也就是说几乎不可能重建神经功能。直到上个世纪90年代,神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的发现彻底改变了损伤神经元不可修复的传统观念。另外,通过近几年的研究发现,各种脑损伤如脑部缺血、脑部创伤和癫痫等都会产生大量可溶性细胞损伤信号,这一信号激活了神经干细胞的新生,选择性地补充了大脑皮层丢失的神经胶质和神经元,为这一类疾病的治疗带来希望。因此,有关神经干细胞的的增殖及其分化的调控机制随即成为神经科学领域的研究热点。α-倒捻子素(α-Mangostin)是从山竹的果皮中分离提取得到的一类酮类化合物,它具有广泛的生物学、药理学活性。并且,α-Mangostin的母核结构与他克林相似,故可推断其衍生物对神经干细胞分化也有一定影响。通过前期的探索实验,发现α-Mangostin的一些衍生物可以促进神经干细胞分化,如果能促进NSCs分化为神经元,则对临床用药具有重大意义。目的:本研究通过原代培养分离获得神经干细胞,并探寻最适合的培养条件。在加入一系列α-倒捻子素衍生物后,利用流式细胞术检测其分化为神经元的比例。同时利用蛋白印迹法(western blot)探究其分化的机制。方法:本研究内容分为三个部分:(1)建立原代培养神经干细胞的方法,分别以1×105个/ml,1×106个/ml,1×107个/ml的密度接种神经干细胞,通过比较找到合适的接种密度。再以机械传代和胰酶传代两种方式进行传代,比较神经干细胞后期生长情况以确定合适的传代方式。在神经干细胞分化后利用免疫荧光法鉴定相应的细胞。(2)设立三个组:阴性对照组(不加抗体处理),不加药组(只加1%胎牛血清),以及加入α-倒捻子素衍生物(100ng/ml)的实验组。分化7天后加入NSE(1:100)抗体进特异性染色,利用流式细胞仪检测其分化为神经元的比例。(3)选择前期实验分化效果最好的一个α-倒捻子素衍生物干预神经干细胞分化,利用蛋白印迹法(western blot)检测干预0,3,5,7,9天后的Axin,β-catenin,Wnt-1,Cyclin D1和Notch-1的蛋白表达。初步探究神经干细胞分化的机制。结果:(1)1×105个/ml接种的神经干细胞大多增殖克隆形成较小团状,只有少数形成小型神经球。1×106个/ml接种的神经干细胞能很好地形成大小合适的神经球。1×107个/ml接种的神经干细胞由于细胞过于密集,形成的神经球过大,神经球中心细胞死亡,且容易贴壁分化。另外,胰酶传代的方式相对机械传代,对细胞损伤更小,第二代神经干细胞状态更好。(2)在流式细胞仪检测结果中,与阴性对照组相比,不加药组和实验组的信号都发生右移。各α-倒捻子素衍生物对神经干细胞的分化均有一定影响,其中以A-GM2在100ng/ml浓度下提高比例最大,由不加药分化的22%提高到约37%,效果显著。(3)通过WB发现Wnt-1在分化前期大量增加,后期减少。Axin在整个分化过程中逐渐减少,在未分化的神经干细胞中含量最高。Axin的减少抑制了β-catenin磷酸化降解,使β-catenin在整个分化过程中含量逐渐增加。β-catenin的增加激活了Wnt信号相关靶基因转录,其下游蛋白Cyclin D1表达增加,同时抑制了Notch-1的表达。结论:(1)1×106个/ml的接种密度以及胰酶传代的方法为最合适的神经干细胞培养条件。(2)α-倒捻子素衍生物有调控神经干细胞分化的功能,对神经干细胞分化为神经元有不同程度的调控作用。(3)Wnt/β-catenin经典信号通路中,通过高表达的Wnt-1与其他蛋白的结合激活了散乱蛋白Dvl,Dvl在细胞内拮抗由蛋白CKI,GSK-3β,Axin和APC所组成的β-catenin降解复合物的活性。导致β-catenin不能通过磷酸化降解。β-catenin的增加激发了Wnt-1相关靶基因的转录,其下游蛋白Cyclin D1表达逐渐增加,从而促进细胞分化。在整个分化过程中Wnt/β-catenin通路与Notch信号通路相互作用,且Notch-1起负调控作用。
【关键词】：α-倒捻子素衍生物 神经干细胞 神经元 Wnt/β-catenin Notch-1
【学位授予单位】：浙江工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96
【目录】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-14
• 缩略词表14-16
• 第一章 绪论16-26
• 1.1 国内外关于本课题的研究进展16-19
• 1.1.1 α-倒捻子素研究进展16-18
• 1.1.2 神经干细胞及其分化研究进展18-19
• 1.2 Nestin,NSE,GFAP与神经干细胞的分化19
• 1.3 流式细胞术在细胞检测中的应用19-20
• 1.4 Wnt/β-catenin信号通路20-21
• 1.5 Notch信号通路21-22
• 1.6 α-倒捻子素衍生物的合成方法22-24
• 1.7 本课题选题及研究意义24-26
• 第二章 神经干细胞的原代培养及鉴定26-37
• 2.1 引言26
• 2.2 实验材料及方法26-30
• 2.2.1 药品试剂及仪器26-27
• 2.2.2 溶液的制备27
• 2.2.3 神经干细胞原代培养27-28
• 2.2.4 细胞接种密度探究方法28-29
• 2.2.5 神经干细胞传代方法29
• 2.2.6 免疫荧光法29-30
• 2.3 实验结果30-35
• 2.3.1 原代培养神经干细胞的形态30-31
• 2.3.2 不同接种密度对神经干细胞生长的影响31-33
• 2.3.3 不同传代方式对神经干细胞生长的影响33-34
• 2.3.4 免疫荧光鉴定结果34-35
• 2.3.5 神经干细胞冻存结果35
• 2.4 讨论35-37
• 第三章 α-倒捻子素衍生物对神经干细胞分化的影响37-46
• 3.1 引言37
• 3.2 实验材料及方法37-40
• 3.2.1 药品试剂及仪器37-38
• 3.2.2 主要溶液配制38
• 3.2.3 不同血清浓度对神经干细胞分化的影响38
• 3.2.4 机械吹打对神经干细胞分化的影响38-39
• 3.2.5 神经干细胞分化实验39
• 3.2.6 神经元细胞鉴定39
• 3.2.7 流式细胞仪检测神经元比例39-40
• 3.2.8 数据处理与统计40
• 3.3 实验结果40-44
• 3.3.1 不同浓度的血清对神经干细胞分化的影响40-41
• 3.3.2 机械吹打对神经干细胞分化的影响41-42
• 3.3.3 流式细胞实验结果42-44
• 3.3.4 免疫荧光结果44
• 3.4 讨论44-46
• 第四章 神经干细胞分化机制的研究46-55
• 4.1 引言46
• 4.2 材料和方法46-51
• 4.2.1 实验药品和仪器46-47
• 4.2.2 溶液配制47-48
• 4.2.3 蛋白质提取48-49
• 4.2.4 蛋白印迹法49-50
• 4.2.5 制胶方法50-51
• 4.3 实验结果51-53
• 4.3.1 Notch-1 蛋白表达结果51
• 4.3.2 β-catenin蛋白表达结果51
• 4.3.3 Wnt-1 蛋白表达结果51-52
• 4.3.4 Axin蛋白表达结果52
• 4.3.5 Cyclin D1蛋白表达结果52-53
• 4.4 讨论53-55
• 总结与展望55-56
• 参考文献56-61
• 致谢61-62
• 硕士期间已发表和待发表的学术论文62

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