双靶修饰策略同时实现阿霉素脂质体肿瘤细胞高度识别与摄取

发布时间：2017-05-22 10:22

  本文关键词：双靶修饰策略同时实现阿霉素脂质体肿瘤细胞高度识别与摄取，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：构建叶酸（Folate， FA）、 TAT肽双靶修饰阿霉素脂质体（FA/TAT-LP-DOX），旨在实现FA主动靶向的同时，增强阿霉素脂质体的细胞摄取，从而提高其抗肿瘤效果；同时研究双靶脂质体FA/TAT-LP-DOX的摄取途径，阐明其发挥作用的机理。 方法：通过酰胺化反应合成脂质材料长链DSPE-PEG_(5000)-FA，加成反应合成短链DSPE-PEG2000-TAT，以薄层色谱（TLC）、红外光谱（FTIR）、氢谱（~1H-NMR）、高效液相色谱（HPLC）等方法分别对合成产物进行表征。采用薄膜分散法及pH梯度法制备阿霉素脂质体（LP-DOX），后插入法制备双靶脂质体。通过测定粒径、Zeta电位、形态、包封率对脂质体进行表征。体外评价中以过度表达叶酸受体的KB细胞作为细胞模型。采用MTT法评价双靶脂质体的细胞毒性；通过荧光显微镜及流式细胞仪定性定量考察双靶脂质体的摄取效率；应用激光共聚焦显微镜观察双靶脂质体在细胞内的分布情况；最后通过流式细胞仪及共聚焦显微镜考察不同抑制剂的摄取抑制作用来阐明双靶脂质体的内吞机制。 结果：脂质材料DSPE-PEG_(5000)-FA经~1H-NMR鉴定，其纯度约为75%，DSPE-PEG2000-TAT经HPLC计算，其TAT肽连接率约为95%。所制备双靶脂质体平均粒径为142.1nm，包封率为92.2%，Zeta电位为4.4mV，证明TAT肽的正电荷被成功掩蔽。透射电镜图（TEM）显示，双靶阿霉素脂质体分布均匀且呈球形。MTT实验表明，配体FA、TAT肽最佳密度分别为5%、2.5%，以此密度构建最优双靶脂质体FA/TAT-LP-DOX，与叶酸单靶脂质体FA-LP-DOX相比，显著（p0.01）提高了细胞毒性。细胞摄取实验证实，，TAT肽与FA存在协同作用，双靶脂质体显著地（p0.01）提高了细胞摄取，其平均荧光强度为单靶叶酸脂质体的1.7倍，摄取速率为单靶叶酸脂质体的1.6倍。共聚焦显微镜及机制考察表明，双靶脂质体通过以网格蛋白为主的多种途径进入KB细胞，递送至溶酶体，并快速释放DOX入核。 结论：本研究构建了粒径均一、包封率高的双靶阿霉素脂质体FA/TAT-LP-DOX，在保留FA主动靶向的基础上，赋予脂质体优越的细胞膜穿透能力，显著地提高了肿瘤细胞毒性。以网格蛋白为主的多种内吞途径促进了双靶脂质体的细胞摄取，有利于其发挥细胞毒作用。双靶修饰策略为设计同时具有靶向及穿透功能的纳米载体提供了新颖的思路及一定实验基础。
【关键词】：阿霉素脂质体 双靶 细胞摄取 摄取机理
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R943;R96
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 第一章 前言11-22
• 1 肿瘤微环境11-13
• 1.1 肿瘤血管新生11
• 1.2 增强渗透及滞留效应11-12
• 1.3 高压环境12-13
• 1.4 低 pH 环境13
• 2 肿瘤靶向策略13-15
• 2.1 被动靶向13
• 2.2 主动靶向13-15
• 2.3 多功能纳米载体15
• 3 脂质体研究进展15-18
• 3.1 免疫脂质体16
• 3.2 长循环脂质体16-17
• 3.3 长循环免疫脂质体17
• 3.4 主动靶向脂质体的新发展17-18
• 4 纳米载体摄取机理18-19
• 5 本课题设计理念及意义19-22
• 第二章 脂质材料的合成与表征22-35
• 1 DSPE-PEG_(5000)-FA 的合成与表征22-26
• 1.1 材料与仪器22
• 1.2 实验方法22-25
• 1.3 实验结果25-26
• 2 DSPE-PEG2000-TAT 的合成与表征26-34
• 2.1 材料与仪器26-27
• 2.2 实验方法27-29
• 2.3 实验结果29-34
• 讨论与小结34-35
• 第三章 双靶脂质体的制备及表征35-41
• 1 材料与仪器35
• 1.1 材料与试剂35
• 1.2 实验仪器35
• 2 实验方法35-38
• 2.1 DOX 体外分析方法的建立35-36
• 2.2 脂质体的制备36-37
• 2.3 脂质体的表征37-38
• 3. 实验结果38-40
• 3.1 DOX 体外分析方法的建立38-39
• 3.2 粒径、Zeta 电位及包封率39
• 3.3 TEM 形态观察39-40
• 讨论与小结40-41
• 第四章 双靶脂质体的体外评价41-55
• 1 材料与仪器41
• 1.1 材料与试剂41
• 1.2 实验仪器41
• 2 实验方法41-44
• 2.1 细胞培养41-42
• 2.2 最佳配体密度的筛选42
• 2.3 细胞毒性考察42
• 2.4 细胞摄取考察42-43
• 2.5 细胞内定位研究43
• 2.6 摄取机理研究43-44
• 2.7 数据统计分析44
• 3 实验结果44-54
• 3.1 最佳配体密度的筛选44
• 3.2 细胞毒性考察44-45
• 3.3 细胞摄取考察45-49
• 3.4 细胞内定位研究49-50
• 3.5 摄取机理研究50-54
• 讨论与小结54-55
• 全文总结55-57
• 课题特色57-58
• 后续工作及展望58-59
• 参考文献59-66
• 攻读硕士学位期间公开发表的论文66-67
• 致谢67-68

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 颜科;胡春梅;潘黎军;王驰;;阿霉素脂质体的制备及对MCF-7/DOX作用的考察[J];重庆医科大学学报;2009年03期

2 于美丽;王勇;舒贵明;朱争艳;方叔昌;王黎;;卵磷脂和氢化卵磷脂长循环阿霉素脂质体的制备及缓释研究[J];北京生物医学工程;2006年06期

3 徐云龙;姜厚友;钱秀珍;马新胜;;pH敏感阿霉素纳米脂质体的制备及性能[J];华东理工大学学报(自然科学版);2008年03期

4 展学强;朱智甲;康经武;;毛细管电泳法测定阿霉素脂质体药物中的微量硫酸根离子[J];色谱;2011年04期

5 ;简讯[J];化工时刊;2007年06期

6 何春龙;刘乐乐;莎日娜;;聚乙二醇修饰药物研究进展[J];内蒙古医学院学报;2007年S1期

7 俞惠新;谭成;张莉;李卫一;林秀峰;陈波;曹国宪;王正武;;两株人肺癌细胞摄取~(99)Tc~m-MIBI的比较[J];核化学与放射化学;2009年04期

8 谭成;俞惠新;林秀峰;杨勇;张莉;陈波;宋翠翠;曹国宪;王正武;;藤黄酸的标记及其小鼠体内分布实验[J];核化学与放射化学;2008年01期

9 杜保中;结构软件“TAT”在崔家寨矿井末煤仓设计中的应用[J];河北煤炭;2002年06期

10 姚彦斌;陈剑;徐宇虹;;替诺福韦阳离子脂质体的制备及其对人体肝细胞SMMC-7721摄取和细胞毒性研究[J];中国药房;2007年34期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 于美丽;舒贵明;朱争艳;方叔昌;王黎;;EPC和HEPC长循环阿霉素脂质体的制备及大鼠体内释药研究[A];创新药物及新品种研究、开发学术研讨会论文集[C];2006年

2 张晓燕;高永良;;抗肿瘤药物脂质体的研究进展[A];2008年中国药学会学术年会暨第八届中国药师周论文集[C];2008年

3 李静;王静霞;孙宝苓;王洛平;;医学实验室TAT运行管理探索[A];中华医学会第九次全国检验医学学术会议暨中国医院协会临床检验管理专业委员会第六届全国临床检验实验室管理学术会议论文汇编[C];2011年

4 李玉肖;高世凤;王芳;文清云;;门诊TAT注射全程无缝隙管理的方法与成效[A];全国外科护理学术交流暨专题讲座会议、全国神经内、外科护理学术交流暨专题讲座会议论文汇编[C];2010年

5 邵衡华;;复发卵巢癌的治疗[A];江苏省抗癌协会妇科肿瘤专业委员会第四次肿瘤学术研讨会暨无锡市妇产科年会论文汇编[C];2005年

6 孙擎;熊俊;冀凯宏;胡凯猛;刘厚奇;;分泌型多肽TAT-CT3-cMyc对白血病HL-60细胞的生长调节[A];中国解剖学会2011年年会论文文摘汇编[C];2011年

7 吴令英;刘丽影;;卵巢上皮癌化疗现状[A];中国临床肿瘤学教育专辑（2001）——中国抗癌协会临床肿瘤学协作中心（CSCO）第五届年会论文集[C];2001年

8 ;大会特邀报告作者介绍[A];第四届长三角妇产科学术论坛暨浙江省2009年妇产科学术年会论文汇编[C];2009年

9 蒋锡群;丁丹;刘成杰;王晶;武伟;;蛋白大分子纳米粒的组装、细胞摄取和药物传输[A];2011年全国高分子学术论文报告会论文摘要集[C];2011年

10 李健;拜晓勃;韩洪起;乔文涛;陈启民;耿运琪;;牛免疫缺陷病毒Tat蛋白抑制宿主细胞RNAi的研究[A];2008年中国微生物学会学术年会论文摘要集[C];2008年

中国重要报纸全文数据库 前10条

1 王进;抗癌领域长期向好[N];医药经济报;2009年

2 朱峰;长循环脂质体的研究[N];中国医药报;2002年

3 周平红;恶性肿瘤的磁性药物靶向治疗[N];中国中医药报;2004年

4 ;力邦，创业中心之“速成生”[N];中国高新技术产业导报;2000年

5 敬松;缓释及控释注射剂研究进展[N];中国医药报;2004年

6 ;国外斥巨资加速研发新产品竞相上市[N];中国医药报;2001年

7 本报记者 于廉荣;上海车展寻找看点[N];中国汽车报;2001年

8 保健时报特约专家 冯建萍;运动治疗十好处[N];保健时报;2007年

9 姜枫 彭勃 尚佳 张庶民;甘露糖结合凝集素与艾滋病相关性的研究[N];中国中医药报;2006年

10 武汉大学中南医院内分泌科主任 徐焱成;糖友夏天少吹空调[N];健康时报;2008年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 麦俊华;基于Tie2的抗肿瘤及新生血管靶向药物输送系统研究[D];上海交通大学;2010年

2 常伟;放射性核素~（99m）Tc标记新型凋亡显像分子探针Tat_（49-57）-DEVD的实验研究[D];华中科技大学;2010年

3 蔡斌;TAT-Ngb融合蛋白的原核表达及其对小鼠脑缺血影响的研究[D];福建医科大学;2010年

4 孙擎;分泌型多肽TAT-CT3-cMyc对白血病HL-60细胞的生长调节[D];第二军医大学;2011年

5 蒋国松;茉莉素的化学结构改造及其抗肿瘤作用研究[D];华中科技大学;2011年

6 周怡;Fortilin和TAT融合蛋白在毕赤酵母的表达及对凡纳滨对虾免疫功能的影响[D];中国海洋大学;2011年

7 刘克海;双功能RGD-TAT修饰的DNA纳米胶束的构建及细胞转运机制研究[D];第二军医大学;2012年

8 刘小海;叶酸受体靶向无功能垂体腺瘤的诊治及其机制研究[D];北京协和医学院;2012年

9 张慧;TAT蛋白转运结构域介导的重组蛋白诱导成体细胞重编程[D];华东师范大学;2013年

10 刘春喜;多功能自组装纳米载体的构建及其细胞内过程研究[D];山东大学;2013年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 朱亚勤;双靶修饰策略同时实现阿霉素脂质体肿瘤细胞高度识别与摄取[D];苏州大学;2013年

2 宁顺花;羧甲基葡聚糖修饰阿霉素脂质体的制备及其性能研究[D];中南大学;2011年

3 尤钊;H-2K~d-Insulin B15-23肽—阿霉素脂质体的制备及初步实验研究[D];扬州大学;2010年

4 杨善祥;羧甲基壳聚糖修饰的盐酸阿霉素脂质体的制备及性能研究[D];华东理工大学;2012年

5 颜露;Tat修饰胰岛素PLGA纳米粒制备及脑靶向研究[D];浙江中医药大学;2012年

6 李晶;TAT-HOXB4蛋白对恒河猴外周血造血干细胞动员效果的研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2010年

7 王琥;二甲基亚砜（DMSO）增强细胞膜穿透肽TAT穿膜效率的实验研究[D];三峡大学;2010年

8 梅丹宇;盐酸阿霉素脂质体脑胶质瘤靶向研究[D];复旦大学;2010年

9 何斌;双荧光载药脂质体与细胞相互作用的研究[D];湖南大学;2009年

10 郭庆国;TAT转导肽作为细胞穿膜载体的体内和体外实验分析[D];中国医科大学;2010年

  本文关键词：双靶修饰策略同时实现阿霉素脂质体肿瘤细胞高度识别与摄取，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：385423