脂肪酶BCLA和CALB在合成替卡格雷及依折麦布手性药物中间体上的应用研究

发布时间：2017-05-27 13:07

  本文关键词：脂肪酶BCLA和CALB在合成替卡格雷及依折麦布手性药物中间体上的应用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：脂肪酶是生物催化中使用最广泛的一类生物催化剂,利用脂肪酶手性拆分酯类药物中间体是合成手性药物的重要方法。洋葱伯克霍尔德氏菌脂肪酶A(BCLA)和南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)是脂肪酶家族中研究较多、作用机理清楚的两种脂肪酶,对外消旋体具有较强的催化活性和立体选择性,在合成手性药物中间体中具有良好的应用前景。本文利用脂肪酶BCLA和CALB对替卡格雷和依折麦布中间体手性拆分的进行了研究。我们将BCLA的基因克隆到pET28(a+)载体中,在大肠杆菌中进行了BCLA表达,形成了包涵体,利用折叠酶B的辅助作用成功地实现了包涵体脂肪酶A的复性。以替卡格雷中间体3为底物对其反应条件进行了优化,结果表明,BCLA拆分该药物中间体的最适温度为60℃,最适pH为7；Co2+和Mn2+对酶活具有促进作用,加入1mM的相应离子可使酶活分别提高1.1和1.27倍。在优化的条件下利用BCLA拆分替卡格雷药物中间体,生成目标产物(1S,4R)-顺-N-苄氧羰基-4-氨基-2-环戊烯-1醇的ee值99%,转化率可达45.7%。(S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酸[(S)-FOA alcohol]是合成依折麦布的关键手性中间体。利用CALB拆分依折麦布中间体对氟苯甲酰基丁酸酯类衍生物,结果表明该酶可以高效地催化外消旋内酯6-(4-氟苯基)-四氢-吡喃-2-酮水解生成(S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酸,其ee值99%,产率为46.7%。利用CALB催化外消旋体6-(4-氟苯基)-四氢-吡喃-2-酮与醇类物质发生转酯化反应,实现了从甲醇到戊醇、异丙醇和叔丁醇的一系列转酯化反应,证明CALB对外消旋体6-(4-氟苯基)-四氢-吡喃-2-酮具有较好的转酯化活性。
【关键词】：洋葱伯克霍尔德氏菌脂肪酶A 南极假丝酵母脂肪酶B 手性拆分 (1S 4R)-顺-N-苄氧羰基-4-氨基-2-环戊烯-1醇 6-(4-氟苯基)-四氢-吡喃-2-酮
【学位授予单位】：北京化工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R914
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-17
• 第一章 绪论17-31
• 1.1 脂肪酶概述17-20
• 1.1.1 脂肪酶定义17
• 1.1.2 脂肪酶的来源17-19
• 1.1.3 脂肪酶的应用19-20
• 1.2 常见的两种脂肪酶20-23
• 1.2.1 Burkholderia cepacia脂肪酶的概述20-21
• 1.2.2 Candida antarctica脂肪酶概述21-23
• 1.3 手性药物23-25
• 1.3.1 手性药物的研究现状23-24
• 1.3.2 手性药物的制备方法24-25
• 1.4 关于几种手性药物中间体25-29
• 1.4.1 替卡格雷和4-氨基2-环戊烯-1-醇25-27
• 1.4.2 依折麦布和对氟苯甲酰基丁酸27-29
• 1.5 课题的研究目的和意义29-31
• 第二章 Burkholderia cepacia脂肪酶和折叠酶基因的克隆及其在大肠杆菌中表达31-49
• 2.1 引言31
• 2.2 实验仪器及材料31-33
• 2.2.1 实验仪器31-32
• 2.2.2 实验材料32
• 2.2.3 培养基32
• 2.2.4 溶液及缓冲液32-33
• 2.3 实验方法33-41
• 2.3.1 洋葱伯克霍尔德氏菌的培养及其基因组的提取33
• 2.3.2 脂肪酶A重组质粒的构建33-36
• 2.3.3 折叠酶B重组质粒的构建36-37
• 2.3.4 脂肪酶、折叠酶的诱导表达37-38
• 2.3.5 重组折叠酶B的纯化38
• 2.3.6 SDS-PAGE凝胶电泳38
• 2.3.7 包涵体BCLA的变性与复性38-39
• 2.3.8 pNPP法测定脂肪酶的活力39-40
• 2.3.9 测定BCLA蛋白质含量40-41
• 2.4 结果分析与讨论41-47
• 2.4.1 Burkholderia cepacia基因组的检测41
• 2.4.2 BCLA和BCLB基因克隆41-42
• 2.4.3 pMD18T-BCLA/BCLB质粒构建42
• 2.4.4 大肠杆菌表达载体pET28(a+)-BCLA和pET28(a+)-BCLB重组质粒的构建42-43
• 2.4.5 大肠杆菌基因工程菌的诱导表达43-44
• 2.4.6 脂肪酶A的纯化44
• 2.4.7 重组折叠酶B的纯化44-45
• 2.4.8 包涵体BCLA的变性与复性45-47
• 2.5 本章小结47-49
• 第三章 BCLA对替卡格雷中间体拆分活性的研究49-61
• 3.1 引言49
• 3.2 实验仪器及材料49
• 3.2.1 实验仪器49
• 3.2.2 实验材料49
• 3.3 实验方法49-51
• 3.3.1 BCLA拆分替卡格雷药物中间体150
• 3.3.2 BCLA拆分替卡格雷药物中间体250
• 3.3.3 BCLA拆分替卡格雷药物中间体350
• 3.3.4 BCLA拆分替卡格雷药物中间体450
• 3.3.5 BCLA底物谱的研究50-51
• 3.4 实验结果与讨论51-58
• 3.4.1 BCLA拆分替卡格雷药物中间体151-52
• 3.4.2 BCLA拆分替卡格雷药物中间体252-53
• 3.4.3 BCLA拆分替卡格雷药物中间体353
• 3.4.4 BCLA拆分替卡格雷药物中间体453-54
• 3.4.5 BCLA对其他药物中间体拆分的研究54-58
• 3.5 本章小结58-61
• 第四章 BCLA拆分替卡格雷中间体反应条件的优化61-67
• 4.1 引言61
• 4.2 实验仪器及材料61
• 4.2.1 实验仪器61
• 4.2.2 实验材料61
• 4.2.3 溶液及缓冲液61
• 4.3 实验方法61-63
• 4.3.1 最适温度的测定61-62
• 4.3.2 最适pH的测定62
• 4.3.3 不同金属离子对酶活的影响62
• 4.3.4 最适反应时间62
• 4.3.5 在最适条件下的底物拆分结果62-63
• 4.4 实验结果与讨论63-66
• 4.4.1 最适温度的测定63
• 4.4.2 最适pH的测定63-64
• 4.4.3 不同离子对底物拆分的影响64-65
• 4.4.4 最适反应时间65
• 4.4.5 在最适条件下的底物拆分结果65-66
• 4.5 本章小结66-67
• 第五章 依折麦布外消旋中间体的合成及检测条件确定67-75
• 5.1 引言67
• 5.2 实验仪器及材料67
• 5.2.1 实验仪器67
• 5.2.2 实验材料67
• 5.3 实验方法67-70
• 5.3.1 依折麦布中间体1的合成68-69
• 5.3.2 依折麦布中间体2的合成69
• 5.3.3 依折麦布中间体3的合成69-70
• 5.3.4 依折麦布中间体对映异构体检测条件的确定70
• 5.4 实验结果与讨论70-73
• 5.4.1 依折麦布中间体1的合成70
• 5.4.2 依折麦布中间体2的合成70-71
• 5.4.3 依折麦布中间体3的合成71
• 5.4.4 依折麦布中间体对映异构体检测条件的确定71-73
• 5.5 本章小结73-75
• 第六章 脂肪酶CALB拆分依折麦布中间体的研究75-81
• 6.1 引言75
• 6.2 实验仪器及材料75
• 6.2.1 实验仪器75
• 6.2.2 实验材料75
• 6.3 实验方法75-76
• 6.3.1 CALB对依折麦布中间体水解反应的研究75-76
• 6.3.2 CALB对依折麦布中间体1转酯化反应的研究76
• 6.4 实验结果与讨论76-79
• 6.4.1 CALB对依折麦布中间体水解反应的研究76-78
• 6.4.2 CALB对依折麦布中间体转酯化反应的研究78-79
• 6.5 本章小结79-81
• 第七章 总结与展望81-83
• 参考文献83-87
• 附录87-97
• 致谢97-99
• 研究成果及发表的学术论文99-101
• 作者与导师简介101-102
• 硕士研究生学位论文答辩委员会决议书102-103

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 张搏;杨江科;闫云君;;假单胞菌脂肪酶的研究进展[J];生物技术通报;2007年02期

2 王炳强;;手性化合物与对映体药物拆分的进展[J];天津化工;2006年04期

3 徐刚;程咏梅;吴坚平;杨立荣;;有机相酶催化拆分制备(S)-2-氯-1-(2-噻吩)-乙醇[J];有机化学;2007年07期

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