模拟微重力对骨髓间充质干细胞增殖和迁移的影响及相关分子机理研究

发布时间：2017-06-29 16:14

  本文关键词：模拟微重力对骨髓间充质干细胞增殖和迁移的影响及相关分子机理研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：空间生命科学是空间科学和生命科学相互渗透形成的一门交叉学科，主要研究宇宙空间环境对生命活动的影响规律及机制。随着空间科学技术的快速发展，空间生命科学逐渐成为生命科学领域的一个热点和前沿。 骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一类具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞，可以在不同培养条件下分化成多种间质细胞，也具有免疫兼容、定向迁移至损伤位点参与组织修复等特点，是临床细胞治疗和组织工程的重要种子细胞，对维持正常生命活动有重要作用。 MSCs的生物学行为受多种环境因素的调控，除化学因素外，力学刺激对MSCs的生物学行为也有重要调节作用。空间环境与地面环境完全不同，，失重是空间特殊环境的主要特点之一。随着航天技术的发展和对太空探索需求的不断增加，人类活动已经频繁进入外层空间。空间微重力环境引起宇航员骨钙含量降低、肌肉系统萎缩、免疫系统紊乱等不良反应，了解空间微重力下MSCs生物学行为的变化特征及规律及其对人体生理活动的影响及机制，对预防和治疗微重力引起的相关疾病具有重要意义。因此，本文采用地基微重力模拟装置，主要考察模拟微重力对大鼠MSCs (rat MSCs, rMSCs)增殖和迁移行为的影响及其相关分子机理。该研究主要有以下4个方面的内容： 1. rMSCs的原代分离培养 本实验结合Percoll密度梯度离心法和差时贴壁法，从大鼠后肢股骨分离rMSCs。用该方法获得的细胞传代后0.5h即可贴壁，24h后完全铺展，多呈长梭形或三角形。细胞具有较强的增殖能力，3~5天即可接近融合，呈漩涡样单层生长。流式细胞仪检测细胞表面相关抗原，结果显示，细胞的CD44和CD90呈阳性，CD34呈阴性，符合MSCs表面标记抗原的一般规律。 2.微重力效应模拟装置 本实验采用中国科学院力学所微重力重点实验室研制的平行平板旋转微重力效应模拟装置，其主体结构包括用于细胞培养的旋转培养腔和产生水平旋转驱动力的单轴旋转支架。该装置的基本原理是通过细胞绕水平轴的旋转，当转速快于细胞重力方向的时间阈值时，细胞因丧失或者降低对固定重力方向的感知而产生类似于空间微重力下的生物学效应。 3.模拟微重力对rMSCs增殖行为的影响及相关分子机理 细胞计数和CCK-8试剂盒检测模拟微重力对rMSCs增殖的影响，发现模拟微重力1天对rMSCs增殖没有明显影响，模拟微重力3天、5天明显抑制rMSCs增殖。 RT-PCR检测模拟微重力对rMSCs中cyclin D1mRNA表达的影响，发现与对照组相比，模拟微重力显著抑制rMSCs中cyclin D1mRNA的表达。模拟微重力作用下rMSCs中β-catenin mRNA的表达没有明显变化。免疫荧光染色发现模拟微重力作用下MSCs的细胞质中游离的β-catenin明显下降，并且β-catenin向细胞核的转移量也降低。模拟微重力环境显著下调MSCs中Wnt3a mRNA的表达，但不影响DKK-1mRNA的表达。结果表明，微重力可能通过抑制经典Wnt信号通路抑制rMSCs增殖。 4.模拟微重力对rMSCs迁移行为的影响及其相关分子机理 Transwell跨膜迁移模型和划痕迁移模型考察了模拟微重力对rMSCs迁移能力的影响。结果显示，模拟微重力作用24h后rMSCs的划痕迁移能力受到明显抑制，恢复重力24h并没有恢复rMSCs的迁移能力。此外，不管是在无血清培养基还是1%血清培养基的诱导条件下，模拟微重力24h后rMSCs的跨膜迁移能力都受到明显抑制。 进一步研究了模拟微重力影响rMSCs迁移行为的机理。原子力显微镜检测结果发现，模拟微重力作用24h显著提高rMSCs的杨氏模量，恢复重力24h后，上调的杨氏模量明显恢复。免疫荧光染色考察模拟微重力对rMSCs中F-actin的影响，结果显示，模拟微重力作用24h明显促进F-actin细胞骨架的表达和聚合，恢复重力24h后，rMSCs中F-actin细胞骨架明显下调。结果表明，模拟微重力下rMSCs迁移能力的下降可能与细胞骨架重构和细胞硬度变化有关。 本文研究结果表明，模拟微重力可能通过下调Wnt3a的表达，降低细胞中游离的β-catenin，减少其向细胞核的转移，下调cyclin D1的表达，最终引起rMSCs增殖的抑制。另一方面，模拟微重力可能通过促进F-actin细胞骨架的表达和聚合，提高细胞硬度，最终降低rMSCs的迁移能力。重力恢复能使F-actin细胞骨架和细胞硬度得到恢复，但是短时间内并不能完全恢复rMSCs的迁移能力。
【关键词】：模拟微重力 骨髓间充质干细胞 增殖 迁移
【学位授予单位】：重庆大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R85
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-11
• 1 绪论11-13
• 1.1 研究背景11-12
• 1.1.1 空间生命科学的发展11
• 1.1.2 骨髓间充质干细胞11
• 1.1.3 模拟微重力对生命活动的影响11-12
• 1.2 本文研究的目的、意义以及主要内容12-13
• 1.2.1 本文研究的目的和意义12
• 1.2.2 本文研究的主要内容12-13
• 2 rMSCs 的原代分离培养13-18
• 2.1 引言13
• 2.2 实验动物、仪器和材料13-14
• 2.2.1 实验动物13
• 2.2.2 实验仪器13
• 2.2.3 实验药品与试剂13-14
• 2.2.4 主要实验试剂的配制14
• 2.3 实验方法14-15
• 2.3.1 rMSCs 的原代分离培养、传代培养14-15
• 2.3.2 流式细胞仪检测细胞表面抗原15
• 2.3.3 统计分析15
• 2.4 实验结果15-17
• 2.4.1 rMSCs 的形态学观察15
• 2.4.2 rMSCs 表面抗原的表达15-17
• 2.5 讨论17
• 2.6 本章小结17-18
• 3 微重力效应模拟装置18-23
• 3.1 引言18
• 3.2 微重力效应模拟装置18-21
• 3.3 讨论21-22
• 3.4 本章小结22-23
• 4 模拟微重力对 rMSCs 增殖的影响及相关分子机理23-36
• 4.1 引言23-24
• 4.2 实验材料24-25
• 4.2.1 主要实验仪器、实验耗材24
• 4.2.2 主要实验药品与试剂24-25
• 4.2.3 主要实验试剂的配置25
• 4.3 实验方法25-29
• 4.3.1 模拟微重力条件下 rMSCs 的培养25-26
• 4.3.2 CCK-8 法检测细胞增殖26
• 4.3.3 细胞计数检测细胞增殖26
• 4.3.4 胶原裱衬26
• 4.3.5 RT-PCR 检测 mRNA 表达变化26-28
• 4.3.6 免疫荧光染色检测蛋白表达变化28-29
• 4.4 实验结果29-33
• 4.4.1 模拟微重力抑制 rMSCs 的增殖29-30
• 4.4.2 模拟微重力对经典 Wnt 信号通路相关蛋白β-catenin、Wnt3a、DKK-1 的影响30-33
• 4.5 讨论33-34
• 4.6 本章小结34-36
• 5 模拟微重力对 rMSCs 迁移的影响及相关分子机理36-46
• 5.1 引言36
• 5.2 实验材料36-37
• 5.2.1 主要实验仪器、实验耗材36
• 5.2.2 主要实验药品与试剂36
• 5.2.3 主要实验试剂的配置36-37
• 5.3 实验方法37-40
• 5.3.1 划痕迁移实验37
• 5.3.2 Transwell 跨膜迁移实验37-38
• 5.3.3 免疫荧光染色检测 F-actin 细胞骨架38-39
• 5.3.4 原子力显微镜检测细胞杨氏模量39-40
• 5.4 实验结果40-43
• 5.4.1 模拟微重力抑制 rMSCs 跨膜迁移和划痕迁移能力40-41
• 5.4.2 模拟微重力增加 rMSCs 的细胞硬度41-42
• 5.4.3 模拟微重力促进 rMSCs 中 F-actin 细胞骨架的重排42-43
• 5.5 讨论43-45
• 5.6 本章小结45-46
• 6 结论与展望46-48
• 6.1 主要结论46
• 6.2 展望46-48
• 致谢48-49
• 参考文献49-56
• 附录56
• A 攻读硕士学位期间发表论文目录56
• B 参加学术会议56
• C 项目（主研人或第一申请人）56

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

1 齐乃明;张文辉;高九州;霍明英;;空间微重力环境地面模拟试验方法综述[J];航天控制;2011年03期

2 张孝谦,袁龙根,吴文东,田兰桥,姚康庄;国家微重力实验室百米落塔实验设施的几项关键技术[J];中国科学E辑:工程科学 材料科学;2005年05期

3 刘承宪;21世纪空间生命科学和空间生物技术发展机遇与挑战[J];空间科学学报;2000年S1期

4 任维,魏金河;空间生命科学发展的回顾、动态和展望[J];空间科学学报;2000年S1期

5 夏益霖;微重力落塔试验技术及其应用(Ⅰ)[J];强度与环境;1995年02期

  本文关键词：模拟微重力对骨髓间充质干细胞增殖和迁移的影响及相关分子机理研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：498502