用悬浮芯片技术定量检测多种病原体的研究

发布时间：2017-07-14 09:25

  本文关键词：用悬浮芯片技术定量检测多种病原体的研究

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【摘要】： 目的：利用悬浮芯片技术，探讨直接从“白色粉末”样品中同时检测5种病原体(细菌、细菌芽孢、病毒、细菌毒素、植物毒素)的可行性，为建立快速、敏感、特异、高通量、同时检测多种生物恐怖因子的技术平台奠定基础。 方法：用抗体包被编码微球作为反应载体，双抗体夹心法为反应模式，建立5种代表性的病原体悬浮芯片检测方法，对“白色粉末”中的鼠疫耶尔森菌、炭疽芽孢、葡萄球菌肠毒素B、蓖麻毒素、SARS冠状病毒同时进行检测。通过盲样和标准实验室检测评估对现场样品的适用性。 结果：建立的悬浮芯片多病原体检测系统具有较高的特异性和敏感性，检测鼠疫耶尔森菌、炭疽芽孢、葡萄球菌肠毒素B、蓖麻毒素、SARS冠状病毒N蛋白的灵敏度分别为67.5 cfu／mL、10~3 cfu／mL、0.203 ng／mL、29.1 ng／mL、4.86 ng／mL，并分别在10~2～10~8 cfu／mL、10~3～10~7 cfu／mL、0.02-152.7 ng／mL、3.56-100852.1ng／mL、0.391-25600 ng／mL浓度范围内具有良好的动力学响应特性，比ELISA方法有较高的灵敏度和较宽动态检测范围。 结论：多病原体悬浮芯片检测系统能快速、敏感、特异、同时地定量检测“白色粉末”中的五种病原体，，在早期识别、快速诊断和应对生物恐怖威胁、传染病暴发中具有广阔的应用前景。
【关键词】：悬浮芯片 检测 双抗体夹心法 生物威胁剂
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R82
【目录】：

• 中文摘要9-10
• 英文摘要10-11
• 本研究中的缩略语11-13
• 引言13-34
• 1 面临生物威胁的形势13-16
• 2. 生物恐怖因子的种类16-18
• 3. 生物恐怖因子的检测技术18-22
• 4. 悬浮芯片及其应用概况22-26
• 5. 本研究的目的、意义26-27
• 参考文献27-34
• 第一部分 悬浮芯片定量检测方法的建立34-62
• 引言34-36
• 1. 材料与方法36-46
• 1.1 材料36-40
• 1.1.1 抗原、抗体36
• 1.1.2 主要试剂36-37
• 1.1.3 缓冲液37-38
• 1.1.4 菌株与培养基38
• 1.1.5 主要耗材38
• 1.1.6 主要仪器38-39
• 1.1.7 悬浮芯片检测仪的结构及用途39-40
• 1.2 方法40-46
• 1.2.1 鼠疫菌F1抗原抗体的制备40
• 1.2.2 BCA法测定蛋白的浓度40
• 1.2.3 抗体包被编码微球40-42
• 1.2.4 生物素标记抗体42-43
• 1.2.5 待测样品制备43-44
• 1.2.6 样品的悬浮芯片检测44-45
• 1.2.7 双抗体夹心ELISA检测45-46
• 1.2.8 方法的特异性检测46
• 1.2.9 定量检测46
• 2. 结果46-57
• 2.1 悬浮芯片检测方法的优化46-52
• 2.1.1 微球包被不同抗体及包被量的优化46-48
• 2.1.2 生物素化抗体的优化48-49
• 2.1.3 双抗夹心法检测鼠疫菌F1抗原抗体配对组合49-51
• 2.1.4 悬浮芯片检测过程的优化51-52
• 2.2 ELISA方法的优化52
• 2.3 悬浮芯片定量检测模型的建立52-54
• 2.3.1 鼠疫菌F1抗原标准曲线52-53
• 2.3.2 确定悬浮芯片检测鼠疫菌F1抗原检测灵敏度和动态范围53-54
• 2.3.3 悬浮芯片定量检测鼠疫菌F1抗原的回收率54
• 2.4 悬浮芯片检测鼠疫菌方法的特异性54-55
• 2.5 悬浮芯片与ELISA方法检测鼠疫菌F1抗原的比较55-57
• 2.5.1 检测方法相关性、灵敏度与动态范围的比较55-57
• 2.5.2 检测30份鼠疫菌F1抗原样品的结果比较57
• 2.5.3 模拟样品检测57
• 3. 讨论57-60
• 4. 小结60
• 参考文献60-62
• 第二部分 病原体多重悬浮芯片检测方法建立与初步评价62-126
• 引言62-66
• 1 材料与方法66-77
• 1.1 材料66-68
• 1.1.1 抗原抗体67
• 1.1.2 菌株67
• 1.1.3 培养基67-68
• 1.1.4 主要耗材68
• 1.2 方法68-77
• 1.2.1 细菌培养及菌液制备68-69
• 1.2.2 待测样品制备69-70
• 1.2.3 抗体包被编码微球70-71
• 1.2.4 生物素化抗体71
• 1.2.5 悬浮芯片单因子分析物检测71
• 1.2.6 悬浮芯片五种病原体多重检测71-74
• 1.2.7 悬浮芯片多重检测方法检测单因子分析物的敏感性实验74-75
• 1.2.8 ELISA检测75
• 1.2.9 干扰背景下悬浮芯片多重检测方法检测能力75-76
• 1.2.10 悬浮芯片定量检测76-77
• 1.2.11 悬浮芯片多重检测方法特异性实验77
• 1.2.12 生物安全防护77
• 2 结果77-112
• 2.1 悬浮芯片检测方法的优化77-80
• 2.1.1 鼠疫菌悬浮芯片检测方法的优化77-78
• 2.1.2 炭疽菌芽孢悬浮芯片检测方法的优化78
• 2.1.3 SEB悬浮芯片检测方法的优化78-79
• 2.1.4 ricin悬浮芯片检测方法的优化79
• 2.1.5 SARS-CoV悬浮芯片检测方法的优化79-80
• 2.2 悬浮芯片五种病原体多重检测模式的建立80-85
• 2.2.1 五种病原体多重检测的悬浮芯片方法优化80-84
• 2.2.2 悬浮芯片内部质控方法的建立84-85
• 2.3 悬浮芯片方法检测病原体的标准曲线85-89
• 2.3.1 悬浮芯片方法检测鼠疫菌的标准曲线与方程式86
• 2.3.2 悬浮芯片方法检测炭疽芽孢的标准曲线与方程式86-87
• 2.3.3 悬浮芯片方法检测SEB的标准曲线与方程式87
• 2.3.4 悬浮芯片方法检测ricin的标准曲线与方程式87-88
• 2.3.5 悬浮芯片方法检测SARS-CoV N蛋白的标准曲线与方程式88-89
• 2.4 X-MAP与ELISA方法检测敏感度和检测范围比较89-94
• 2.4.1 鼠疫菌检测89-90
• 2.4.2 炭疽芽孢检测90-91
• 2.4.3 SEB检测91-92
• 2.4.4 蓖麻毒素A检测92
• 2.4.5 SARS-CoV N蛋白检测92-94
• 2.4.6 X-MAP方法与ELISA方法检测样品结果的吻合性比较94
• 2.5 X-MAP方法检测目的分析物在有其他对象干扰情况下的灵敏度94-96
• 2.5.1 检测鼠疫菌94-95
• 2.5.2 检测SARS-CoV N蛋白95-96
• 2.6 X-MAP方法的特异性96-98
• 2.7 X-MAP定量检测五种病原体98-101
• 2.7.1 X-MAP依次定量检测单种病原体98-100
• 2.7.2 背景干扰条件下目标物定量检测100-101
• 2.8 “白色粉末”污染样品检测结果101-108
• 2.8.1 不同粉末样品中炭疽芽孢的检测101-102
• 2.8.2 奶粉人工污染样品中鼠疫菌定量检测102-103
• 2.8.3 奶粉人工污染样品中炭疽芽孢定量检测103-104
• 2.8.4 奶粉人工污染样品中SEB定量检测104-105
• 2.8.5 奶粉人工污染样品中ricin定量检测105-106
• 2.8.6 奶粉人工污染样品中SARS-CoV N蛋白定量检测106-107
• 2.8.7 不同粉末污染样品中多病原体检测107-108
• 2.9 样品测试108-110
• 2.10 盲样检测110-112
• 3 讨论112-117
• 4 小结117-118
• 参考文献118-126
• 第三部分 结论126-127
• 1、建立了编码微球蛋白质悬浮芯片的标准实验方法126
• 2、建立了多种类病原体悬浮芯片检测技术126
• 3、评价了方法的敏感性、特异性、重复性、准确性126
• 4、实现了定量检测126
• 5、考核对粉末样品的定性、定量检测能力126-127
• 综述127-144
• 发表论文144-145
• 申请或获得专利145-146
• 致谢146

【引证文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 徐华;顾大勇;胡春凌;李永进;史蕾;刘春晓;赵纯中;张妮奇;徐云庆;姜声扬;;四种重要生物恐怖毒素液相芯片多重检测方法的建立[J];中国国境卫生检疫杂志;2012年03期

2 刘丽娟;姜超;杨永莉;王莎莎;于珊珊;王旺;;液相芯片检测3种发热伴出疹病毒方法的建立[J];中国国境卫生检疫杂志;2012年05期

本文编号：540568