黑木耳肽钙螯合物对模拟微重力诱导骨流失防护作用研究

发布时间：2017-07-28 16:38

  本文关键词：黑木耳肽钙螯合物对模拟微重力诱导骨流失防护作用研究

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【摘要】：近些年来,我国载人航天事业飞速发展,随之而来的失重性骨流失问题已不容忽视。航天飞行中机体会出现骨钙流失,骨密度减小,骨骼机械强度下降等现象,在返回地面后短时间内仍无法完全恢复;这不仅会危及航天员的生命健康,而且可能会影响到航天任务的执行与开展情况。本研究首次以黑木耳蛋白为载体,深入研究其水解肽与钙离子形成的金属离子螯合物对模拟微重力诱导骨流失的防护作用。该肽钙螯合物既可以通过机体对肽的特殊吸收机制加速其在微重力环境下中对钙离子的吸收和利用,提高其生物学效价;同时也为黑木耳蛋白等天然产物提取物的应用提供了一个新的思路和方向。本课题主要研究内容如下:黑木耳蛋白提取条件的优化:首次研究压力对黑木耳蛋白提取效果的影响,通过比较高压、减压与常压条件下黑木耳蛋白得率的高低,确定高压均质法为黑木耳蛋白的最优提取方法,最佳提取条件为料液比1:104g/mL,均质压力25 MPa,均质时间25 min,蛋白得率可达5.35%。蛋白水解方法及条件的筛选:对所得黑木耳蛋白分别进行不同时间的酶解和碱解,通过研究不同水解肽及其肽钙螯合物对体外成骨细胞(OB)促增殖活性作用的差异筛选出最优肽段,并确定胰蛋白酶酶解为水解方法,酶解条件为pH 8.0,37℃条件下酶解30 min;该条件下所得肽钙螯合物促OB增殖率可高达90%。黑木耳多肽的纯化:采用半制备型高效液相设备对最优肽段的功能组分进行分离纯化,通过比较不同出峰时间所得组分及对应的肽钙螯合物促OB增殖活性的差异确定主要功能组分为AP-2。并对AP-2的蛋白分子量及其氨基酸组成进行分析与测定。研究结果表明主要功能组分AP-2为分子量为10573 Da多肽,该多肽含所有人体必需氨基酸,富含缬氨酸和蛋氨酸,是一类优质的植物蛋白资源。肽钙螯合条件的优化:分别以肽钙螯合比,螯合pH,螯合时间和螯合温度为单因素,以促OB增殖率作为响应值,通过响应面优化法确定功能组分AP-2与钙离子螯合物的最佳工艺条件为肽钙比2.4:1,pH 9.0,螯合时间63 min及螯合温度68℃,该条件下促OB增殖率可达98.2%。模拟微重力诱导骨流失体外防护作用研究:采用二维双相多样本回转器(2D-RWVS)系统建立骨流失模型,研究结果表明功能组分AP-2与钙离子所形成的螯合物可有效增加模拟微重力下OB中钙含量,并能够提高其碱性磷酸酶(ALP)活力,对模拟微重力诱发的骨流失具有一定程度的防护作用。模拟微重力诱导骨流失体内防护作用研究:以昆明小鼠为试验对象,采用尾吊法建立空间微重力模型。动物实验结果表明黑木耳肽钙螯合物不仅可以有效恢复模拟微重力引起的免疫脏器损伤,并能够减少小鼠负重骨中骨密度的下降,增加骨中无机矿物盐含量;而且能够显著抑制血清中抗酒石酸酸性磷酸酶(StrACP)活力,提高ALP活力,对模拟微重力诱导的骨流失具有一定程度的防护作用。本课题为开展空间微重力诱导骨流失防护途径的研究提供了理论基础,并对进一步开发新型骨流失防护剂提供了一定的价值;同时,对地面骨质疏松的研究具有一定的参考意义。
【关键词】：黑木耳 肽钙螯合物 模拟微重力 骨流失防护
【学位授予单位】：哈尔滨工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R85
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-12
• 第1章 绪论12-30
• 1.1 课题来源及研究背景和意义12-13
• 1.2 空间微重力环境及其诱导骨流失的研究进展13-20
• 1.2.1 空间微重力环境及其影响13-14
• 1.2.2 空间微重力诱导失重性骨流失14-20
• 1.3 空间微重力诱导骨流失的防护现状20-23
• 1.3.1 生理防护措施21-22
• 1.3.2 药物防护措施22
• 1.3.3 营养防护措施22-23
• 1.4 植物蛋白研究现状23-24
• 1.4.1 植物蛋白的功能活性研究现状23-24
• 1.4.2 黑木耳蛋白的国内外研究现状24
• 1.5 金属离子螯合物的国内外研究现状24-26
• 1.5.1 金属离子螯合物功能活性研究现状25
• 1.5.2 肽钙螯合物的国内外研究现状25-26
• 1.6 实验课题研究内容26-30
• 1.6.1 实验研究内容26-28
• 1.6.2 实验技术路线28-30
• 第2章 材料与方法30-48
• 2.1 实验材料30-32
• 2.1.1 材料与试剂30-31
• 2.1.2 实验仪器设备31-32
• 2.2 实验原料制备32-37
• 2.2.1 黑木耳蛋白提取方法优化32-35
• 2.2.2 黑木耳蛋白水解条件优化35-37
• 2.3 黑木耳最佳肽段的筛选37-40
• 2.3.1 成骨细胞的提取37-38
• 2.3.2 成骨细胞的鉴定38-39
• 2.3.3 成骨细胞增殖活性研究39
• 2.3.4 黑木耳肽段的筛选39-40
• 2.4 黑木耳肽段的纯化及其氨基酸分析40-41
• 2.4.1 黑木耳多肽功能性成分纯化40
• 2.4.2 纯化组分分子量测定40-41
• 2.4.3 纯化组分氨基酸组成分析41
• 2.5 黑木耳多肽与钙离子螯合工艺优化41-43
• 2.5.1 肽钙螯合工艺的单因素实验41-42
• 2.5.2 肽钙螯合工艺的响应面优化42
• 2.5.3 肽钙螯合物的红外表征42-43
• 2.6 肽钙螯合物对模拟微重力诱导骨流失的体外防护作用研究43-44
• 2.6.1 模拟微重力细胞模型建立43
• 2.6.2 测定指标与方法43-44
• 2.7 肽钙螯合物对模拟微重力诱导骨流失的体内防护作用研究44-47
• 2.7.1 模拟微重力小鼠尾吊模型建立44-45
• 2.7.2 测定指标与方法45-47
• 2.8 实验数据处理..47-48
• 第3章 黑木耳多肽的制备48-71
• 3.1 黑木耳蛋白提取方法优化48-57
• 3.1.1 高压均质法对黑木耳蛋白得率的影响48-54
• 3.1.2 减压提取法对黑木耳蛋白得率的影响54-56
• 3.1.3 饱和硫酸铵溶液法盐析黑木耳蛋白56-57
• 3.2 黑木耳蛋白水解条件确定57-62
• 3.2.1 酶解法对黑木耳蛋白水解效果的影响..57-60
• 3.2.2 碱解法对黑木耳蛋白水解效果的影响60-62
• 3.3 成骨细胞提取与鉴定62-65
• 3.3.1 成骨细胞提取..62-63
• 3.3.2 成骨细胞生长曲线.63
• 3.3.3 成骨细胞鉴定 .63-65
• 3.4 不同黑木耳多肽促成骨细胞增殖活性的影响65-69
• 3.4.1 酶解黑木耳多肽促成骨细胞增殖活性的影响65-67
• 3.4.2 碱解黑木耳多肽促成骨细胞增殖活性的影响67-68
• 3.4.3 最佳黑木耳多肽的筛选68-69
• 3.5 本章小结69-71
• 第4章 黑木耳多肽功能组分的纯化71-76
• 4.1 黑木耳多肽纯化结果及功能组分筛选71-72
• 4.2 功能组分AP-2 相对分子量的测定72-74
• 4.2.1 Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳法72-73
• 4.2.2 液质联用(HPLC-MS)分析法73-74
• 4.3 功能组分AP-2 氨基酸组成分析74-75
• 4.4 本章小结75-76
• 第5章 黑木耳多肽功能组分与钙离子螯合工艺优化76-86
• 5.1 肽钙螯合工艺的单因素实验结果76-79
• 5.1.1 pH对肽钙螯合效果的影响76-77
• 5.1.2 肽钙螯合比对肽钙螯合效果的影响77
• 5.1.3 螯合时间对肽钙螯合效果的影响77-78
• 5.1.4 螯合温度对肽钙螯合效果的影响78-79
• 5.2 肽钙螯合工艺的响应面优化结果79-84
• 5.3 肽钙螯合物红外表征结果84-85
• 5.4 本章小结85-86
• 第6章 肽钙螯合物对模拟微重力诱导骨流失的体外防护作用研究86-91
• 6.1 肽钙螯合物对成骨细胞中蛋白含量的影响86-87
• 6.2 肽钙螯合物对成骨细胞中钙含量的影响87-88
• 6.3 肽钙螯合物对成骨细胞中碱性磷酸酶活力的影响88
• 6.4 肽钙螯合物对成骨细胞中抗酒石酸酸性磷酸酶活力的影响88-89
• 6.5 本章小结89-91
• 第7章 肽钙螯合物对模拟微重力诱导骨流失的体内防护作用研究91-104
• 7.1 肽钙螯合物对尾吊小鼠体重的影响91-93
• 7.1.1 各组雌性小鼠体重变化91-92
• 7.1.2 各组雄性小鼠体重变化92-93
• 7.2 肽钙螯合物对尾吊小鼠免疫脏器的影响93-95
• 7.2.1 各组雌性小鼠免疫器官指数93-94
• 7.2.2 各组雄性小鼠免疫器官指数94-95
• 7.3 肽钙螯合物对尾吊小鼠骨密度及股骨指数的影响95-97
• 7.3.1 各组雌性小鼠骨密度和股骨指数95-96
• 7.3.2 各组雄性小鼠骨密度和股骨指数96-97
• 7.4 肽钙螯合物对尾吊小鼠股骨中无机物及有机物的影响97-99
• 7.4.1 肽钙螯合物对尾吊小鼠股骨中无机物的影响97-98
• 7.4.2 肽钙螯合物对尾吊小鼠股骨中有机物的影响98-99
• 7.5 肽钙螯合物对尾吊小鼠血清中蛋白和钙含量的影响99-101
• 7.5.1 各组小鼠血清中蛋白含量99-100
• 7.5.2 各组小鼠血清中钙含量100-101
• 7.6 肽钙螯合物对尾吊小鼠血清中骨代谢相关酶活力的影响101-102
• 7.6.1 各组小鼠血清中碱性磷酸酶活力101
• 7.6.2 各组小鼠血清中抗酒石酸酸性磷酸酶活力101-102
• 7.7 本章小结102-104
• 结论104-106
• 参考文献106-119
• 攻读博士学位期间发表的论文及其它成果119-121
• 致谢121

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本文编号：585037