基于代谢组学的人参总皂苷改善模拟微重力导致的学习记忆功能减退机制研究

发布时间：2017-08-18 02:10

  本文关键词：基于代谢组学的人参总皂苷改善模拟微重力导致的学习记忆功能减退机制研究

  更多相关文章： 代谢组学 LC-MS 学习记忆功能减退 人参总皂苷 学习记忆改善

【摘要】：航天特因环境如微重力和慢性睡眠剥夺会导致肌肉萎缩、骨质疏松、免疫功能和学习记忆能力下降等多种机体损伤或功能障碍。航天员在太空飞行中需要保持良好的认知状态以完成多种精细复杂的操作任务。因此,航天特因环境对学习记忆能力的影响越来越受到重视,但其机制仍不完全清楚,此外,有效的防护措施也十分缺乏。人参是传统名贵益智中药,大量研究证实其主要活性成分人参皂苷对学习记忆功能具有显著改善作用。代谢组学是一种近年来新兴的系统生物学研究方法,其整体性、灵敏性和无偏性的特点使其有助于从体内代谢的角度阐明航天特因环境对学习记忆能力影响的机制和人参发挥学习记忆能力改善作用的调节靶点。本文主要研究内容和结果如下：1.采用尾部悬吊后肢去负荷法建立了模拟微重力(Microgravity, MG)大鼠模型并采用人参总皂苷(Ginseng total saponins, GTS)对其进行干预。在7天的尾吊过程中,每日监测大鼠的摄食、摄水和体重。尾吊结束后,采用穿梭行为学检测方法对其学习记忆能力进行评价；然后,采集其血液、胸腺、肾上腺、脾脏和全脑以测定其血浆皮质酮(Corticosterone, CORT)水平、胸腺、肾上腺和脾脏的脏器指数和进行基于甲苯胺蓝的尼氏体染色以观察其海马CA1区椎体神经元的形态。结果显示,与空白对照组相比,尾吊造成了大鼠体重增长显著减慢,学习记忆能力明显降低,血浆CORT水平显著升高,胸腺和脾脏显著萎缩和肾上腺明显水肿,海马CA1区椎体神经元显著损伤。口服GTS (100mg/kg体重)能明显改善大鼠的学习记忆能力,降低升高的血浆CORT水平,缓解胸腺和脾脏萎缩和肾上腺水肿,减轻海马椎体神经元损伤。2.建立了尿液、血浆及海马组织超高效液相色谱-四极杆-时间飞行质谱(UPLC-QTOF-MS)分析方法。在方法建立过程中,首先对3种生物样品的前处理方法进行了优化；接着对流动相洗脱梯度、进样体积、柱温等液相色谱条件以及毛细管电压、离子源温度、锥孔电压、脱溶剂气体温度和流速等质谱条件、方法精密度和重复性以及样品稳定性等进行优化和考察,建立了针对3种生物样品的最佳分析条件。3.采用建立的UPLC-QTOF-MS分析方法对暴露于7天的模拟MG及GTS干预后大鼠的尿液、血浆和海马组织进行了非靶向代谢组学研究。在该研究中,首先对采集到的原始LC-MS数据进行格式转换,采用R语言软件包XCMS和CAMERA进行代谢物的色谱峰提取、非线性保留时间校正和峰注释；将处理得到的含有样本名称、m/z值和峰强度的三维数据表格导入到SIMCA-P软件中进行主成分分析(PCA)和偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA),将筛选到的潜在生物标志物进行方差分析或t检验以验证其组间差异,p0.05时认为组间差异显著；采用在线质谱数据库和原始LC-MS多级质谱数据进行代谢物的结构鉴定；最后对鉴定到的生物标志物的生物学意义进行阐释。结果发现,暴露于7天的模拟MG后,大鼠尿液、血浆和海马组织的代谢物轮廓发生显著改变,口服GTS能明显缓解这些改变；在尿液、血浆和海马组织中分别鉴定到了11、12和17种生物标志物。和学习记忆密切相关的生物标志物有犬尿喹啉酸、缬氨酸、胆碱、色氨酸、多种鞘氨醇和磷脂酸。涉及到的代谢通路包括色氨酸代谢、神经递质合成、鞘氨醇和磷脂酸代谢、嘌呤和嘧啶代谢等。4.采用超快速液相色谱-串联质谱(UFLC-MS/MS)法对暴露于7天的模拟微重力和GTS干预后大鼠尿液、血浆和海马组织中在非靶向研究中鉴定到的代谢通路涉及到的33种代谢物、海马组织中的8种神经递质(乙酰胆碱(Ach)、多巴胺(DA)、γ-氨基丁酸(GABA)、5-羟色胺(5-HT)、谷氨酸(Glu)、高香草酸(HVA)、肾上腺素(E)和去甲肾上腺素(NE))进行了定量测定；采用高效液相色谱-荧光检测法(HPLC-FLD)对血浆中16种氨基酸进行了定量测定；结合相关矩阵分析、层序聚类分析、热图分析、代谢通路和富集分析、受试者工作特征曲线(ROC)分析和方差分析等数据分析和处理方法对研究结果进行解读和阐释。结果发现,在靶向验证研究中,在尿液、血浆和海马组织中分别鉴定到16、10和17种生物标志物。其中色氨酸、犬尿氨酸、赖氨酸、胱硫醚在尿液和海马中同时被检测到；苯丙氨酸、天冬氨酸和天冬酰胺在血浆和海马中同时被检测到；酪氨酸和苏氨酸在3种生物样品中同时被检测到。GTS能将大多数鉴定到的生物标志物向正常对照组方向回调。ROC分析结果发现,尾吊主要通过影响酪氨酸、色氨酸、天冬酰胺、犬尿喹啉酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、胆碱、缬氨酸和3-羟基犬尿氨酸的水平而损伤学习记忆能力；GTS主要通过回调酪氨酸、色氨酸、天冬酰胺、犬尿喹啉酸的水平改善学习记忆能力。神经递质测定发现,与正常对照组相比,除NE外,其他7种神经递质的水平均显著改变。其中,Glu和5-HT水平升高,其他5种神经递质水平降低；GTS能将大多数神经递质的水平向正常对照组方向回调,特别是使Glu、Ach和HVA调节到正常水平。氨基酸测定结果发现,与正常对照组相比,在尾吊大鼠体内,10种氨基酸(Thr、Ala、Met、Val、Leuu、His、He、Asp、Phe、Glu)的水平显著改变,其中,Glu水平升高,其他9种氨基酸的水平降低；GTS能使多数氨基酸的水平向正常方向回调,特别是使Phe调节到正常水平。5.采用基于UPLC-QTOF-MS的非靶向代谢组学方法,结合新物体偏好和时序判断行为学测试和血清皮质酮(CORT)、脑组织丙二醛(MDA)、过氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)水平测定研究了慢性睡眠干扰(CSI)对小鼠学习记忆能力影响的分子机制。结果发现,2周的CSI能显著降低小鼠的学习记忆能力；升高血清CORT和脑组织MDA水平；降低脑组织SOD和CAT水平。鉴定到的与学习记忆能力下降密切相关的生物标志物有胆碱、缬氨酸、尿酸、尿囊酸、类视甾体化合物、肉碱类化合物。与正常对照组相比,在CSI小鼠血清中,尿酸、尿囊酸和肉碱类化合物的水平显著升高；类视甾体化合物、胆碱和缬氨酸水平显著降低。本文首次采用非靶向和靶向代谢组学相结合的方法,从机体内源性代谢物的角度系统研究了模拟航天特因环境对学习记忆能力影响的分子机制及GTS改善学习记忆的调节靶点。结果表明,模拟航天特因环境可通过引起多种内源性代谢通路失调而致学习记忆功能减退；GTS主要通过调节氨基酸、神经递质和犬尿氨酸等物质的代谢发挥学习记忆改善作用。本研究有助于为航天特因环境导致的学习记忆功能减退早期预警和早期药物防护提供科学依据。
【关键词】：代谢组学 LC-MS 学习记忆功能减退 人参总皂苷 学习记忆改善
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R852.22
【目录】：

• 英文缩略词表9-10
• 摘要10-13
• Abstract13-17
• 第1章 前言17-38
• 1.1 代谢组学概述17-29
• 1.1.1 代谢组学的概念、特点和分类17-20
• 1.1.2 代谢组学研究流程20-29
• 1.2 微重力对机体的直接影响29-30
• 1.3 微重力诱导的应激对机体的影响30-31
• 1.4 人参的抗应激和益智作用31-32
• 1.5 研究目的、意义及研究内容32-34
• 1.5.1 研究目的和意义32
• 1.5.2 研究内容32-34
• 参考文献34-38
• 第2章 模拟微重力大鼠模型的建立及人参总皂苷干预38-62
• 2.1 药品与试剂39
• 2.2 仪器与设备39-40
• 2.3 实验动物40
• 2.4 实验方法40-48
• 2.4.1 动物分组及给药40
• 2.4.2 模拟微重力大鼠模型的建立40-41
• 2.4.3 体重、摄食及摄水量测定41-42
• 2.4.4 穿梭箱测试42
• 2.4.5 胸腺、肾上腺、脾脏的采集及脏器指数计算42-43
• 2.4.6 血浆皮质酮水平及尼氏体染色43
• 2.4.7 人参皂苷提取物的制备及含量测定43-48
• 2.4.8 数据统计处理48
• 2.5 实验结果48-55
• 2.5.1 体重48-49
• 2.5.2 摄食和摄水量49-51
• 2.5.3 穿梭箱测试51-53
• 2.5.4 尾吊对大鼠脏器指数的影响53-55
• 2.5.5 尼氏体染色55
• 2.5.6 皮质酮水平55
• 2.6 讨论55-57
• 2.6.1 模型建立55-56
• 2.6.2 摄食、摄水和体重56
• 2.6.3 穿梭箱测试和血浆皮质酮水平56-57
• 2.6.4 免疫功能57
• 2.6.5 海马神经元57
• 2.7 本章小结57-59
• 参考文献59-62
• 第3章 基于UPLC-QTOF-MS的非靶向代谢组学分析方法的建立62-93
• 3.1 药品及试剂62
• 3.2 仪器和设备62-63
• 3.3 实验方法63-69
• 3.3.1 实验动物和样本采集63-64
• 3.3.2 尿液样品UPLC-QTOF-MS分析方法的建立64-66
• 3.3.3 血浆样品UPLC-QTOF-MS分析方法的建立66-69
• 3.3.4 海马样品UPLC-QTOF-MS分析方法的建立69
• 3.4 结果69-89
• 3.4.1 尿液样品分析方法优化69-81
• 3.4.2 血浆样品分析方法优化81-88
• 3.4.3 海马样品分析方法建立88-89
• 3.5 讨论89-91
• 3.5.1 尿液样品89-90
• 3.5.2 血浆和海马组织样品90-91
• 3.6 本章小结91-92
• 参考文献92-93
• 第4章 基于非靶向代谢组学的人参总皂苷改善模拟微重力导致的学习记忆功能减退机制研究93-122
• 4.1 药品及试剂94
• 4.2 仪器与设备94
• 4.3 实验动物94
• 4.4 实验方法94-97
• 4.4.1 模拟微重力大鼠模型的建立及药物干预94
• 4.4.2 尿液、血浆及海马组织样品的采集和前处理94-95
• 4.4.3 尿肌酐含量测定方法95
• 4.4.4 质控样品制备95
• 4.4.5 样品分析95-96
• 4.4.6 数据处理及生物标志物结构鉴定96-97
• 4.5 结果97-115
• 4.5.1 尿肌酐含量97-100
• 4.5.2 代表性色谱图100-104
• 4.5.3 分析方法验证104-106
• 4.5.4 模式识别和潜在生物标志物鉴定106-114
• 4.5.5 生物标志物结构鉴定114-115
• 4.6 讨论115-118
• 4.6.1 尿液中代谢物水平校正115-116
• 4.6.2 模拟微重力对整体代谢轮廓的影响116-118
• 4.7 本章小结118-119
• 参考文献119-122
• 第5章 基于靶向代谢组学的人参总皂苷改善模拟微重力导致的学习记忆功能减退机制研究122-172
• 5.1 药品及试剂123
• 5.2 仪器与设备123-124
• 5.3 实验动物124
• 5.4 实验方法124-132
• 5.4.1 模拟微重力大鼠模型的建立及药物干预124
• 5.4.2 尿液、血浆及海马组织样品的采集和前处理124
• 5.4.3 靶向验证研究124-128
• 5.4.4 海马组织神经递质测定128-130
• 5.4.5 血浆氨基酸水平测定130-132
• 5.5 实验结果132-164
• 5.5.1 靶向验证研究132-147
• 5.5.2 海马组织神经递质测定147-155
• 5.5.3 血浆氨基酸水平测定155-164
• 5.6 讨论164-168
• 5.6.1 靶向验证研究164-165
• 5.6.2 海马神经递质165-166
• 5.6.3 血浆氨基酸166-168
• 5.6.4 其他受影响的代谢通路168
• 5.7 本章小结168-169
• 参考文献169-172
• 第6章 慢性睡眠干扰对学习记忆能力影响的代谢组学研究172-192
• 6.1 药品及试剂173
• 6.2 仪器和设备173
• 6.3 实验方法173-177
• 6.3.1 实验动物173-174
• 6.3.2 慢性睡眠干扰小鼠模型制备174-175
• 6.3.3 行为学检测175-176
• 6.3.4 血清和脑样品的采集和制备176
• 6.3.5 统计分析176-177
• 6.3.6 LC-MS条件177
• 6.3.7 数据采集和预处理177
• 6.3.8 多元统计分析177
• 6.3.9 生物标志物结构鉴定177
• 6.4 实验结果177-185
• 6.4.1 行为学测试,体重和生化指标177-179
• 6.4.2 方法重复性和可靠性179-180
• 6.4.3 模式识别和潜在生物标志物鉴定180-185
• 6.5 讨论185-188
• 6.5.1 行为学评价185-186
• 6.5.2 生化指标186-187
• 6.5.3 血清代谢物对慢性睡眠干扰的反应187-188
• 6.6 本章小结188-189
• 参考文献189-192
• 第7章 全文总结与展望192-196
• 7.1 主要研究结果192-193
• 7.2 创新点193-194
• 7.3 展望194-195
• 参考文献195-196
• 附录196-197
• 致谢197-198
• 读博期间的主要科研成果198-200

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 黎阳;张铁军;刘素香;陈常青;;人参化学成分和药理研究进展[J];中草药;2009年01期

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本文编号：692169