nNOS源性NO对心肌细胞L-型钙通道的抑制性保护作用

发布时间：2017-09-07 05:34

  本文关键词：nNOS源性NO对心肌细胞L-型钙通道的抑制性保护作用

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【摘要】：【背景】 近年来我国载人航天事业迅猛发展，航天员在轨时间逐步延长。但是长期暴露于失重环境下人体会出现立位耐力不良现象，这是由体液丧失、心肌收缩性能降低和血管发生适应性重塑[1,2]三方面共同作用所导致。失重环境下体液丧失所致心脏前负荷下降是导致心肌收缩性能降低的重要原因，而失重具体通过哪种机制引起心肌收缩性能下降，尽管研究很多，目前尚不清楚。本实验室前期的研究发现尾部悬吊大鼠心肌细胞神经型一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase, nNOS）表达下降伴有活性降低。大量研究表明nNOS主要定位于心肌细胞的肌质网和细胞膜，并作用于受磷蛋白（phospholamban, PLB）、雷诺啶受体（ryanodine receptor, RyR）、L-型钙通道（L-type calcium channel, LTCC）等等位点[3]，改变nNOS的表达量可以影响心肌的收缩与舒张功能[4]。LTCC作为兴奋-收缩偶联的关键步骤，我们推测失重条件下nNOS表达量的降低可能通过改变LTCC门控特性影响心肌收缩性能，因此本研究通过建立尾部悬吊大鼠模型，主要研究nNOS对LTCC门控特性的影响。 【目的】 (1)分离存活比例高、功能好和保存时间长的心肌细胞。 (2)观察4周模拟失重尾部悬吊大鼠（tail-suspended rats, SUS）及其同步对照（control,CON）组心肌nNOS表达量和活性变化，以及心肌LTCC(α1C)表达量的改变。 (3)在SUS组和CON组心肌细胞，观察一氧化氮（nitric oxide, NO）对LTCC通道门控特性及其对异丙肾上腺素（isoproterenol, ISO）反应性的调节作用。 【方法】 利用本科室已建立的尾部悬吊大鼠模型模拟失重条件下心脏变化，western blot方法检测SUS组和CON组心肌nNOS和LTCC(α1C)表达量的差异，荧光法检测nNOS活性变化。采用膜片钳实验方法全细胞模式检测SUS组和CON组心肌LTCC通道门控特性的变化，包括激活特性、失活特性和恢复特性。 【结果】 (1)大容量细胞保存液可以长时间维持心肌细胞功能 急性分离大鼠心肌细胞代谢旺盛，消耗保存液中营养物质并产生大量代谢产物，导致小容量保存液（20ml）pH值逐渐降低，异常形状细胞比例增加，细胞线粒体膜电位绝对值降低，细胞自发荧光逐渐由线粒体还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide, NADH）蓝色荧光转变为肌原纤维的绿色荧光，细胞I_(Ca.L)峰值幅度降低。大容量细胞保存液（100ml）营养物质丰富，缓冲能力强，可以长时间维持液体pH于稳定水平，进而维持线粒体膜电位，保持细胞长时间处于功能良好状态。 (2)4周尾部悬吊大鼠心肌nNOS表达量与活性均降低；LTCC的α1C亚基表达量不变 Western blot方法检测SUS组与CON组NOSs表达量的改变，结果显示SUS组nNOS表达量显著下降，而内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase,eNOS）表达量无显著变化。使用一氧化氮荧光探针DAF-FM DA检测发现：与CON大鼠相比，4w SUS组总NOS活性降低，nNOS活性降低，NO产生量减少。SUS组与CON组心肌LTCC的α1C亚基表达量之间无显著差别。 (3)在异丙肾上腺素（ISO）刺激条件下，nNOS源性NO对心肌细胞LTCC具有抑制性保护作用 与CON组相比，SUS组基础状态下LTCC电流-电压曲线（I-V曲线）左移且峰值增大，通道半激活电压（Va0.5）绝对值增加，激活斜率因子（ka）不变，提示通道容易激活；稳态失活50%对应脉冲电压与斜率因子不变，提示失活特性无差异；通道恢复时间常数（）缩短，提示恢复加速。在ISO刺激下，CON组I_(Ca.L)峰值增加，通道半激活电压绝对值增加，激活斜率因子降低，提示通道激活加速；稳态失活50%对应脉冲电压（Vi0.5）与斜率因子（ki）未改变，提示失活特性未改变；恢复时间常数缩短，提示恢复加快，恢复百分比增加，提示恢复充分；然而，SUS组I_(Ca.L)峰值增加幅值显著低于CON组；SUS组通道半激活电压绝对值较CON组减小，激活斜率因子高于CON组，提示SUS组通道激活减慢；稳态失活50%对应脉冲电压绝对值高于CON组，斜率因子与CON组无差别，提示SUS组通道容易失活；恢复时间常数无差异，但是恢复百分比较CON组减小，提示通道恢复不充分，上述结果表明SUS组心肌细胞LTCC对ISO反应性降低且通道门控特性受损。 nNOS特异性抑制剂灌流5min后，与基础状态相比，CON组I_(Ca.L)峰值增加；半激活电压绝对值增加，激活斜率因子无变化，提示通道容易激活；稳态失活50%对应脉冲电压与斜率因子未改变，提示失活特性未改变；恢复时间常数缩短，提示恢复加速。nNOS特异性抑制剂和ISO联合灌流5min，与单纯ISO刺激相比，CON组I_(Ca.L)峰值降低；半激活电压绝对值降低，激活斜率因子增加，提示通道激活减慢；稳态失活50%对应脉冲电压绝对值增加，斜率因子无差异，提示通道容易失活；恢复时间常数无差异，，但是恢复百分比降低，提示恢复不充分。上述结果表明CON组nNOS被抑制后，LTCC对ISO反应性降低且通道门控特性受损。 NO供体SNAP（S-nitroso-N-acetylpenicillamine）灌流5min后，与基础状态相比，CON组I_(Ca.L)峰值无差异；半激活电压绝对值增加，激活斜率因子降低，提示通道激活加速；稳态失活50%对应脉冲电压与斜率因子未改变，提示失活特性无差异；恢复时间常数缩短，提示恢复加速。SNAP和ISO联合灌流5min后，与单纯ISO刺激相比，CON组I_(Ca.L)峰值降低；半激活电压绝对值降低，激活斜率因子增加，提示通道激活减慢；稳态失活50%对应脉冲电压与斜率因子未改变，提示失活特性无差异；通道恢复时间常数和恢复百分比均无差异。上述结果表明NO过多可抑制通道开放，降低ISO刺激下I_(Ca.L)增加幅度，但不损伤通道门控特性。 【结论】 在功能与形态良好的心肌细胞进行膜片钳实验，采取降低与增加NO的方式，观测心肌细胞LTCC对ISO的反应性与通道特性，证明nNOS源性NO对心肌细胞LTCC具有抑制性保护作用。
【关键词】：神经型一氧化氮合酶 L-型钙通道 心肌细胞 心肌保护
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R852.22
【目录】：

• 缩略语表4-6
• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-14
• 前言与文献回顾14-23
• 一、心肌细胞的分离与保存方法23-34
• 1.1 引言23-24
• 1.2 实验方法24-26
• 1.3 实验结果26-31
• 1.4 讨论31-34
• 二、影响 L-型钙通道电流记录的膜片钳实验条件34-40
• 2.1 引言34
• 2.2 实验方法34-35
• 2.3 实验结果35-37
• 2.4 讨论37-40
• 三、nNOS 源性 NO 对心肌细胞 L-型钙通道的抑制性保护作用40-65
• 3.1 引言40
• 3.2 实验方法40-46
• 3.3 实验结果46-60
• 3.4 讨论60-65
• 小结65-67
• 参考文献67-73
• 个人简历和研究成果73-74
• 致谢74

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 张然,余志斌,王云英;成年小鼠心肌细胞分离技术[J];生理学报;2004年05期

本文编号：807706