基于自噬调控肿瘤相关巨噬细胞表型极化探讨消水方治疗恶性胸腔积液的作用机制

发布时间：2020-03-18 08:27

【摘要】：恶性胸腔积液(malignantpleuraleffusion,MPE)是肿瘤晚期常见的并发症,往往伴随严重的症状,如呼吸困难、疼痛、恶病质和体力减少等,且临床预后差,中位生存期仅为3-12个月。MPE的临床仍以姑息性治疗为主,包括胸腔穿刺引流、胸膜固定术、胸膜腔内化疗药物注射等,但多疗效有限。近十年来MPE的病理生理机制研究有了重要进展,揭示了 MPE形成的生物学过程。胸膜肿瘤可以干扰胸腔引流、宿主血管以及免疫系统,导致胸膜腔液体吸收减少,渗出增多,从而促进MPE的行程。在这一过程中,胸腔肿瘤血管生成、胸膜血管通透性增加、肿瘤生长和局部免疫炎性微环境发挥了重要作用。深入剖析MPE形成的生物学过程也为其临床治疗研究提供了新的方向。中药消水方药物由葶苈子、石韦、椒目、徐长卿、瓜萎、生黄芪、泽泻、半枝莲、灵芝、白术、大枣组成。全方具有健脾利水,扶正抗癌的功效。前期临床研究发现中药消水方联合胸腔内灌注顺铂治疗恶性胸腔积液,可显著减轻患者临床症状,改善生存质量。基础动物实验研究也证实中药消水方可以减少小鼠胸腔恶性胸腔积液的形成,同时延长MPE模型小鼠的存活时间。机制研究提示中药消水方对肿瘤细胞作用较弱,但对胸腔免疫细胞具有一定调控作用。我们前期预实验发现消水方可以减少MPE中M2型肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophages,TAMs)的表达。M2型巨噬细胞是促进MPE形成的关键因素,而TAMs自噬是调控巨噬细胞M2型极化的重要途径。因此,我们提出消水方可能通过干预TAMs自噬,调控其表型极化,进而减少MPE的形成。研究目的通过观察消水方对MPE中肿瘤相关巨噬细胞自噬水平的影响,从调控巨噬细胞表型极化的角度揭示消水方抑制MPE形成的细胞分子机制,旨在阐释消水方减少MPE的科学内涵,同时为进一步应用中医药治疗MPE提供科学依据。研究方法1.采用胸腔注射小鼠来源的Lewis肺癌细胞的方法建立C57BL/6小鼠Lewis肺癌胸腔积液模型,并比较不同Lewis细胞浓度对小鼠MPE模型的影响;2.通过小动物活体成像等技术观察中药消水方对模型小鼠体重、胸腔积液、胸壁转移瘤、胸腔肿瘤负荷以及生存期的影响;3.通过尾静脉注射依文思蓝染液、免疫组化检测CD31/CD34表达以及Luminex检测VEGF,观察消水方对小鼠胸膜通透性及肿瘤血管新生的作用;4.通过流式细胞技术检测CD206、CD16/32表达和Luminex检测IL-10、IL-12、TNFα表达,从体内及体外两方面观察消水方对巨噬细胞表型的调控作用;5.通过Western blot检测p62与LC3表达、MDC及LC3免疫荧光等方法从体内及体外两方面观察消水方对巨噬细胞自噬的调控作用;6.通过自噬抑制剂及激动剂验证消水方调控巨噬细胞表型与自噬的关系;7.通过体外诱导建立M1及M2型巨噬细胞,观察消水方对M1型和M2型巨噬细胞的调控作用;8.通过Western blot检测消水方对肿瘤相关巨噬细胞PI3K/Akt/mTOR通路及AMPK/mTOR/ULKl通路的影响。研究结果1.高浓度组(5.0×106cells/ml)小鼠成模率较高,10只小鼠有9只出现胸水,同时14天时小鼠胸水量平均796ul,胸腔内有较多肿瘤组织,胸壁也有较多转移瘤,平均14个,相较于其他两组均具有统计学差异;2.消水方组相比于对照组小鼠MPE体积明显减少;但对胸壁转移瘤消水方组与对照组无显著差异;小动物活体成像显示消水方组3、7、10天各组荧光值无显著差异,第14天消水方组小鼠胸腔荧光值稍低于对照组,差异具有统计学意义;14天时消水方组小鼠体重明显优于顺铂组及模型对照组;相比于模型对照组,消水方组小鼠具有更长的生存期,差异具有统计学意义。3.消水方组胸水、外周血依文思蓝浓度比值低于对照组,胸水VEGF表达水平也低于对照组,免疫组化显示胸膜肿瘤CD31及CD34表达也低于模型对照组,差异均具有统计学意义。4.消水方组小鼠胸腔巨噬细胞CD206表达降低,CD16/32表达增高,相比于对照组差异具有统计学意义;消水方组小鼠恶性胸腔积液IL-10表达降低,IL-12表达增高,TNF-α表达降低,相比于对照组差异具有统计学意义;体外共培养模型中,消水方组巨噬细胞CD206表达降低,CD16/32表达增高,培养液上清中IL-10表达降低,IL-12表达增高,差异也具有统计学意义;5.消水方组小鼠胸水细胞p62蛋白表达降低,LC3-Ⅱ/Ⅰ比值升高;消水方组小鼠胸膜肿瘤组织p62蛋白表达、LC3-Ⅱ/Ⅰ比值以及LC3免疫荧光表达与对照组无差异;体外共培养模型中,消水方组巨噬细胞p62蛋白表达降低,LC3-Ⅱ/Ⅰ比值升高,MDC免疫荧光值较对照组增强,差异均具有统计学意义;6.消水方+雷帕霉素组巨噬细胞CD16/32表达增加,CD206表达降低;而消水方+3-MA组巨噬细胞CD16/32表达降低,CD206表达增加,相比于单用消水方组差异均具有统计学意义;消水方+雷帕霉素组IL-10表达更低,差异具有意义,IL-12则无明显差异;消水方+3MA组IL-10表达升高,IL-12表达降低,差异具有意义;7.Ml型巨噬细胞消水方组与对照组CD206、CD16/32以及培养液上清IL-10、IL-12表达均无差异;M2型巨噬细胞消水方组巨噬细胞CD206表达降低,CD16/32表达增高,培养液上清中IL-10表达降低,IL-12表达增高,差异具有统计学意义;M1型巨噬细胞中,消水方组与对照组p62蛋白、LC3蛋白表达及MDC荧光值无明显统计学意义,M2型巨噬细胞中,消水方组p62蛋白表达降低,LC3-LC3-Ⅱ/Ⅰ比值增高,MDC免疫荧光值较对照组增强,差异均具有统计学意义;8.消水方组肿瘤相关巨噬细胞p-AMPK、p-ULKl(Ser555)表达升高,p-AKT、p-mTOR 及 p-ULKl(Ser757)的表达降低,AMPK、ULK1、mTOR 及 AKT表达无明显差异。研究结论1.消水方可以抑制小鼠MPE生成,改善小鼠体重,延长小鼠生存期,但对胸腔肿瘤作用有限;其抑制MPE生成可能与降低胸膜通透性、抑制血管生成有关;2.消水方可以通过上调TAMs自噬水平调控其表型极化,促使MPE中M2型TAMs向M1型转化;3.消水方促进自噬调控TAMs表型的作用可能与调控AMPK/mTOR/ULKl及PI3K/AKT/mTOR通路有关。
【图文】：

自噬,巨噬细胞,机制

逦中国中医科学院２０１５级博士学位论文逦逡逑结构域２邋（ＮＯＤ２）信号通路激活巨噬细胞自噬［２（）：１。近来研宄证实自噬对巨噬细逡逑胞具有重要调节作用［２１＿２３］。因此自噬，巨噻细胞和癌症之间存在紧密的联系，可逡逑以通过调节巨噬细胞中的自噬来增强抗肿瘤反应。鉴于巨噬细胞和自噻在肿瘤进逡逑展中的重要作用及其在生物学活性中的相关性，有必要阐明自噬在调控的巨噬细逡逑胞中的作用及潜在分子机制。在下面的内容中，我们将总结自噬在调节巨噬细胞逡逑产生和极化中的重要性，，并讨论自噬在调节ＴＡＭｓ的促进肿瘤功能方面的作用。逡逑

机制,巨噬细胞,恶性胸腔积液,中医药治疗

于自嗔调控肺瘤相关巨噬细胞表型极化探讨消水方治疗恶性胸腔积液的作用机近十余年来，由于动物模型的改良，ＭＰＥ的机制研宄蓬勃发展，ＭＰＥ制由传统的淋巴回流阻塞单因素转向多因素共同作用。胸膜微环境中的（如胸膜间皮细胞、内皮细胞）以及髓源性、淋巴系统的细胞（如单核细粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞）等与肿瘤细胞的相互作用，影响了肿瘤的、血管通透性增高和炎症的发生等，最终导致ＭＰＥ的形成［６，７］（见图１．２．１当前ＭＴＯ现代机制的研宄进展，学者们对中医药治疗ＭＰＥ的具体机深入探讨。从早期研究促胸膜粘连作用，到近来探讨抑制血管生成及通的机制；从研宄调控机体免疫，到关注对局部免疫微环境的干预，中医ＰＥ的机制研宄也经历由粗到细、由浅到深的过程。在这些研宄中，中现出一定的效果，同时也体现了中医药治疗“多系统、多靶点”的特点［３］
【学位授予单位】：中国中医科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5

【参考文献】