青蒿琥酯对糖尿病牙周组织炎症反应及骨代谢的影响

发布时间：2020-03-19 10:43

【摘要】：目的:通过体内实验,观察糖尿病状态下牙周组织的改变,并以青蒿琥酯(Artesunate,ART)进行干预,检测青蒿琥酯对糖尿病大鼠牙周组织炎症反应及骨代谢的影响。同时,通过体外实验,检测ART对糖尿病状态骨髓间充质干细胞(Bone marrow stromal cells,BMSCs)增殖及成骨分化的影响。探讨ART在伴糖尿病牙周病防治中的应用前景与价值。方法:(1)体内实验:选取健康SD大鼠40只,体重200~220 g,随机分成5组:健康对照组、糖尿病对照组(DM组)、糖尿病ART 50 mg/kg用药组(DM+ART 50 mg/kg组)、糖尿病ART 100 mg/kg用药组(DM+ART100 mg/kg组)和糖尿病胰岛素用药组(DM+Insulin组),每组8只。DM组、DM+ART 50 mg/kg组、DM+ART 100 mg/kg组和DM+Insulin组大鼠经60 mg/kg链脲佐菌素腹腔注射诱导形成糖尿病,正常组注射等比例生理盐水,以空腹血糖大于16.7 mmol/L作为诱导成功的糖尿病大鼠模型血糖参数标准。DM+ART 50 mg/kg组和DM+ART 100 mg/kg组分别给予50 mg/kg、100 mg/kg ART灌喂,对照组和DM组给予等量生理盐水灌喂,DM+Insulin组给予6 U/kg胰岛素皮下注射,每日给药1次,共给药4周。期间每日观察大鼠一般状况,每周测量空腹血糖和体重。第4周末处死大鼠,收集上颌牙槽骨、牙周组织及胰腺组织。采用苏木精-伊红(HE)染色观察组织病理学改变;免疫组化法检测牙龈IL-1β、TNF-α和上颌牙槽骨ALP、OCN表达情况;荧光定量PCR法检测上颌牙槽骨ALP、OCN、RUNX2表达情况。(2)体外实验:选取4周龄SD大鼠,分离胫骨和股骨,采用全骨髓贴壁法分离,并采用免疫荧光法检测CD34、CD44表达情况进行鉴定,获得BMSCs。将BMSCs置于高糖培养基和不同浓度ART干预的环境中,实验分组为:对照组(含5.5 mM葡萄糖的DMEM培养基)、12 mM高糖组、12 mM葡萄糖+ART 1μM用药组(12 mM Glc+1μM ART组)、12 mM葡萄糖+ART 3μM用药组(12 mM Glc+3μM ART组)、25 mM高糖组、25 mM葡萄糖+ART 1μM用药组(25 mM Glc+1μM ART组)、25 mM葡萄糖+ART3μM用药组(25 mM Glc+3μM ART组)。采用CCK8法检测各组BMSCs增殖情况;采用碱性磷酸酶活性实验检测各组BMSCs碱性磷酸酶活性;采用荧光定量PCR检测各组BMSCs的ALP、OCN、RUNX2 mRNA表达情况。结果:1、口腔牙周状况观察,糖尿病大鼠口腔卫生状况差,可见较多食物残留,游离龈和龈乳头多呈暗红色,偶见牙龈肿胀,质地松软,易出血,其中DM组大鼠症状最严重,DM+ART 50 mg/kg组、DM+ART 100 mg/kg组组和DM+Insulin组症状较轻,各组大鼠均未见明显的牙松动和牙缺失。对照组大鼠口腔卫生状况良好,牙龈呈浅红色,未见牙松动和牙缺失。2、DM组大鼠牙龈上皮增厚,棘层增生,上皮钉突伸长呈水滴状或融合成网状。可见龈沟上皮增生,形成钉突,周围大量炎症细胞浸润。结缔组织排列紊乱,可见网状纤维被破坏,且结缔组织内血管增生、扩张、充血,周围见大量炎症细胞浸润。松质骨可见明显病理改变,骨小梁变细、弯曲、排列紊乱,骨小梁连续性被破坏,常见有破骨细胞吸收骨质所形成的骨吸收陷窝。DM+ART 50 mg/kg组、DM+ART 100 mg/kg组、DM+Insulin组和对照组大鼠牙龈上皮角化明显,棘层细胞排列紧密,结缔组织内网状纤维排列整齐,少见炎症细胞浸润。DM+ART 50 mg/kg组、DM+ART 100mg/kg组和DM+Insulin组骨松质区骨小梁排列较整齐,但骨小梁较细,破骨细胞少见。对照组骨松质区骨小梁粗大,排列整齐,相互连接构成网状结构,骨小梁间距较小,破骨细胞少见。3、免疫组织法检测牙龈组织中IL-1β、TNF-α表达情况,DM组牙龈中IL-1β、TNF-α表达最高,与其他组比较差异具有显著性意义(P0.05);DM+ART 50 mg/kg组、DM+ART 100 mg/kg组、DM+Insulin组和对照组表达水平相近,差异无显著性意义(P0.05)4、免疫组织法检测上颌牙槽骨中ALP、OCN表达情况,DM组上颌牙槽骨中ALP、OCN表达最低,与其他组比较差异具有显著性意义(P0.05);DM+ART 50 mg/kg组、DM+ART 100 mg/kg组和DM+Insulin组表达水平相近,差异无显著性意义(P0.05);对照组上颌牙槽骨表达最高,与其他组比差异具有显著性意义(P0.05)。5、荧光定量PCR法检测上颌牙槽骨ALP、OCN、RUNX2 mRNA表达情况。DM组上颌牙槽骨中ALP、OCN、RUNX2 mRNA表达最低,与其他组比较差异具有显著性意义(P0.05);DM+ART 50 mg/kg组、DM+ART100 mg/kg组和DM+Insulin组表达水平相近,差异无显著性意义(P0.05);对照组表达最高,与其他组比差异具有显著性意义(P0.05)。6、CCK8法检测ART及高糖对BMSCs增殖的影响:1μM和3μM ART对BMSCs不产生细胞毒性作用,12 mM和25 mM高糖环境会抑制BMSCs的增殖,经1μM和3μM ART干预后,BMSCs增殖能力得到部分恢复,但仍低于对照组。7、BMSCs碱性磷酸酶活性实验:对照组碱性磷酸酶活性最高,与其他组比较差异具有显著性意义(P0.05),12 mM高糖组和25 mM高糖组最低,1μM和3μM ART干预后碱性磷酸酶活性上升,但仍比对照组低。8、荧光定量PCR法检测BMSCs的ALP、OCN、RUNX2 mRNA表达情况:对照组ALP、OCN、RUNX2表达最高,与其他组比较差异具有显著性意义(P0.05);12 mM高糖组和25 mM高糖组表达最低,1μM和3μM ART干预后表达水平上升,但仍比对照组低。结论:(1)体内实验:糖尿病大鼠牙周组织存在慢性炎症,且颌骨成骨能力受损,但并未发展成牙周炎。ART可对糖尿病大鼠牙龈炎症发挥显著的抗炎作用,同时部分恢复糖尿病大鼠颌骨受损的成骨能力。(2)体外实验:高糖环境下BMSCs增殖和成骨分化能力受损。ART干预后,高糖环境下BMSCs的增殖和成骨分化能力得到部分恢复,但仍低于正常环境BMSCs。
【图文】：

组、DM+ART 50 mg/kg 组、DM+ART 100 mg/kg 组和 DM经 1%链脲佐菌素腹腔注射后状态良好，进食正常，精神状 周末、2 周末检测空腹血糖，均达到糖尿病判定标准。成模鼠逐渐表现出多饮多食多尿症状，并有精神萎靡、活动减少状，同时体重并无明显增长，甚至体重减轻。对照组大鼠饮满，好动，体重稳定上升。口腔牙周状况观察，糖尿病大鼠差，可见较多食物残留，游离龈和龈乳头多呈暗红色，偶见地松软，，易出血，其中 DM 组大鼠症状最严重，DM+ART +ART 100 mg/kg 组和 DM+Insulin 组症状较轻，但各组大牙松动和牙缺失。对照组大鼠口腔卫生状况良好，牙龈呈浅松动和牙缺失。

图 1-2 各组大鼠体重变化情况Fig. 1-2 Changes in body weight of rats in each group腺 HE 染色观察结果脲佐菌素对动物的胰岛 β 细胞具有选择性破坏的作用，从而糖尿病。因此，本实验从各组随机抽取 3 只大鼠胰腺组织，观察其病理学改变以判断糖尿病模型建立情况。对照组大鼠正常，胰岛形态正常，未见明显病理改变。DM 组、DM+ART +ART 100 mg/kg 组和 DM+Insulin 组大鼠胰腺内外分泌部萎少，且萎缩变小，胰岛内 β 细胞数量少，排列紊乱。
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5

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本文编号：2590121