【摘要】：近年来,阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)患者数量呈持续上升趋势,平均每3秒全球增加一名AD患者,而我国是全球增长速度最快的国家。但其发病机制复杂、靶点多样,治疗仍是难点。中药多成分、多靶点的特色已成为治疗AD的首选,与靶点明确的西药联用不仅疗效显著而且降低不良反应。经过调查发现,临床上最常用的是将银杏酮酯和多奈哌齐联用,但两药联用的量效关系和作用机制尚不明确。因此本论文以银杏酮酯-多奈哌齐为研究对象,结合现代分析技术和药学评价手段对其进行量效关系和物质基础研究,运用分子生物学技术对其作用机理进行探究。第一章文献研究本章系统综述了阿尔茨海默病的现代研究状况、中西医结合治疗的现状以及临床常用药银杏酮酯-多奈哌齐联合应用的进展。第二章银杏酮酯-多奈哌齐两药联用抗阿尔茨海默病的量效关系研究第一节不同剂量的银杏酮酯-多奈哌齐抗阿尔茨海默病效应研究本节采用多因素损伤复制小鼠痴呆模型,给予不同剂量的银杏酮酯-多奈哌齐(G、D、GD 0.5 ×、GD 1 ×、GD 2 ×、GD 4 ×、GD6×、GD8×、GD 10×)进行治疗后,通过观察Morris水迷宫行为学、分析脑组织病理切片和脑、血浆中神经递质及其相关酶指标的变化来评价药效,再结合多指标综合指数法和主成分分析(PCA)筛选两药联用的最佳剂量。结果发现,与正常组比较,模型组的行为学、神经递质及其酶含量均有统计学差异(P0.01或P0.05);与模型组比较,不同剂量给药组对各指标有一定改善作用,且改善效果不一。综合多指标综合指数和PCA得出:GD 1 ×GD 0.5 ×GD 2 ×GD 6 ×DGD 4 ×GGD 8 ×GD 10 ×,表明银杏酮酯-多奈哌齐临床1倍量(GD 1 ×)时效果最佳。第二节不同配比的银杏酮酯-多奈哌齐抗阿尔茨海默病效应研究基于优选的最佳剂量对银杏酮酯-多奈哌齐不同配比(GD 1:0、GD 2:1、GD 3:1、GD 4:1、GD 8:1、GD 1:1、GD 1:8、GD 1:4、GD 1:3、GD 1:2和GD 0:1)进行研究,依次对Morris水迷宫、脑病理切片和血脑中神经递质及相关酶的变化进行分析,结合多指标综合指数法和PCA筛选两药联用的最佳配比。结果发现,与正常组比较,模型组各指标都表现出显著性差异(P0.01或P0.05);与模型组比较发现,不同配比给药组对各指标有一定回调作用(P0.01或P0.05)。综合多指标综合指数法和PCA得出:GD 1:1GD 1:2GD 1:3GD 0:1GD 1:0GD 2:1GD 1:4GD 1:8GD 3:1GD 8:1GD 4:1,表明两药在一定范围内起配伍增效作用,其中银杏酮酯-多奈哌齐1:1时(GD 1:1)效果最佳。第三章基于“脑-肠-肠道菌群”轴的银杏酮酯-多奈哌齐抗阿尔茨海默病联用增效的体内、外过程研究第一节银杏酮酯-多奈哌齐两药联用在模型小鼠组织和血液中的分布研究基于前期筛选出的最佳配比(1:1),本节对单用和联用后成分进行追踪评价分析。在多因素损伤致小鼠痴呆模型复制完成后,连续给药10天,通过UHPLC-MS/MS检测38种成分在模型小鼠脑、肠、肠内容物和血浆中含量分布情况。结果发现,多奈哌齐、金松双黄酮、芦丁等成分在联用后在脑中的含量升高,推测药物联用后促进这些成分透过血脑屏障的能力发挥神经保护作用。黄酮类成分在体内各组织和血液中均有分布;黄酮苷类成分和银杏酸类成分在体内分布较少;内酯类成分仅在肠内容物中检测到。第二节银杏酮酯中特征成分的体外胃肠道代谢研究本节建立体外模拟人肠道菌代谢技术,采用UPLC-Q-TOF-MS技术对银杏酮酯特征性成分(槲皮素-3-O-α-L-(6'"-p-香豆酰葡萄糖基-β-D-1,2-鼠李糖苷))在正常和病理状态下不同时间段的肠道菌群中代谢产物进行研究,以期寻找正常和病理状态下的代谢差异。结果发现,在正常和病理状态下主要有以下几种差异:(1)代谢反应发生时间差异;(2)代谢反应类型存在差异;(3)代谢产物种类差异。第四章基于“脑-肠-肠道菌群”轴的银杏酮酯-多奈哌齐抗阿尔茨海默病联用增效的机理研究第一节银杏酮酯-多奈哌齐联用对阿尔茨海默病鼠的肠道菌群组成谱影响越来越多的研究表明肠道菌参与AD的发病,基于此,本节采用16S rDNA基因测序技术考察痴呆小鼠体内肠道菌群的改变及银杏酮酯-多奈哌齐单用和联用给药后对痴呆小鼠肠道菌群多样性的调节作用。结果发现,与正常组比较,模型组小鼠肠道菌的丰富度和多样性降低,其中厚壁菌门、放线菌门、乳酸杆菌属和埃希氏菌属的丰度显著降低(P0.01或P0.05);拟杆菌门、变形菌门和链球菌属的丰度显著增加(P0.01或P0.05)。给药治疗后,不同程度的改善了模型鼠体内菌群的丰度,表明银杏酮酯-多奈哌齐联用后通过提高益生菌数量来改善模型鼠的肠道菌群结构发挥增效作用机制。第二节脑肠肽信号分子调节作用的银杏酮酯-多奈哌齐抗阿尔茨海默病联用增效的机理研究本节采用蛋白免疫印迹法和实时定量PCR法对正常组、模型组、银杏酮酯-多奈哌齐联用组小鼠的脑、肠中乙酰胆碱酯酶(Acetyl cholinesterase,AChE)、乙酰胆碱转移酶(Choline acetyltransferase,ChAT)、单胺氧化酶B(Monoamine oxidase b,MAO-b)、血管活性肠肽(Vasoactive intestinal polypeptide,VIP)、P物质(Substance P,SP)和神经肽Y(Neuropeptide Y,NPY)的蛋白含量和mRNA基因表达进行分析。结果发现,与正常组比较,模型组小鼠脑、肠中的这些指标蛋白含量和mRNA表达均有显著性差异;与模型组比较,给药后脑肠中的MAO-b和VIP蛋白表达和mRNA表达有显著的回调作用(P0.01或P0.05),其余各指标表现出相应回调的趋势。提示银杏酮酯-多奈哌齐联用组可能通过调节这些相关指标蛋白含量和mRNA表达发挥增效作用,尤其是MAO-b和VIP的改善效果最明显。第三节神经递质调节作用的银杏酮酯-多奈哌齐抗阿尔茨海默病联用增效的机理研究本节首次建立UHPLC-MS/MS在6 min内对正常组、模型组、银杏酮酯组、多奈哌齐组和联用组小鼠的脑、肠、肠内容物和血浆中的15个神经递质类成分进行含量测定,以期来探究联用增效的机制。结果发现,L-谷氨酸为代表的兴奋性氨基酸在模型小鼠脑、肠中大量释放,对神经元造成损伤;有保护神经元作用的抑制性氨基酸(γ-氨基丁酸、L-甘氨酸、L-丙氨酸和牛磺酸)和单胺类神经递质(肾上腺素,多巴胺、5-羟色胺和去甲肾上腺素)在模型小鼠的脑、肠中释放较少;此外,神经递质的代谢产物(5-羟基吲哚乙酸和高香草酸)和其他类别的神经递质在模型小鼠体内释放含量异常,与正常组相比表现出显著性差异。给药之后,与模型组相比,有一定的治疗作用。表明银杏酮酯-多奈哌齐可能是通过调节神经递质在各组织的释放来达到增效作用的。第四节神经营养分子调节作用的银杏酮酯-多奈哌齐抗阿尔茨海默病联用增效的机理研究本节采用多因素损伤致痴呆模型和东莨菪碱诱导记忆障碍模型,探讨神经营养因子在增效治疗AD中的作用。通过蛋白免疫印迹法对正常、模型和给药小鼠BDNF的蛋白表达进行分析。结果发现,在多因素损伤模型中,模型鼠脑和肠中的BDNF蛋白含量明显降低(P0.05),给药后小鼠有回调趋势,但未见显著性差异;在东莨菪碱诱导的模型中,模型鼠脑中的BDNF和TrkB蛋白含量明显下降(P0.001),给药后有明显升高的趋势,且与模型组有显著性差异。提示,银杏酮酯-多奈哌齐可能通过对BDNF-TrkB通路的调控作用起到联用增效的作用。本论文首先建立了多因素损伤痴呆模型,对银杏酮酯和多奈哌齐两药联用不同量比抗AD关系进行了研究,结果发现两药联用最佳配比为GD1:1临床等效量效果最佳;接着运用现代分析技术,从体内药物分布变化及体外肠道菌群孵育差异探讨银杏酮酯-多奈哌齐两药联用的物质基础,发现多奈哌齐、金松双黄酮、芦丁、咖啡酸和绿原酸可以增强透过血脑屏障的能力发挥增效作用;最后基于肠道菌组成谱、脑肠肽分子、神经递质和神经营养因子4个方面对两药联用机制进行了初步探索,发现两药联用后显著提高肠道菌中益生菌数量,这些益生菌释放或抑制一部分脑肠肽分子和神经递质,它们进一步通过肠神经系统间接作用于大脑。
【图文】：
图１－１－ｈ邋２０１８年美国６５岁及以上老年人患有阿尔茨海默病或其他痴呆症的护理总费用分逡逑
图２－１－２各组小鼠定位航行轨迹图逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－１－２邋Ｎａｖｉｇａｔｉｏｎ邋ｍａｐｓ邋ｏｆ邋ｅａｃｈ邋ｇｒｏｕｐ邋ｍｉｃｅ逡逑
【学位授予单位】：南京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5
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本文编号：2596958
