葛根提取物工艺标准及其复方的质量控制与抗仓鼠AS研究

发布时间：2020-03-25 03:07

【摘要】：目前,心脑血管疾病占我国居民疾病死亡构成的40%以上,是我国居民死亡的第一大原因,而且患病率和死亡率仍处在上升阶段,因此,亟待开发或对已有药物进行优化得到疗效确切的预防和治疗心脑血管疾病的药物。中药葛根及其复方是临床常用药,在心脑血管疾病的预防和治疗方面应用广泛。异黄酮类成分是葛根中的活性成分,本研究以此为出发点,建立葛根中多种异黄酮成分的指纹图谱或“化学条形码”及质量控制方法,并以此为评价指标对葛根提取物的制备工艺进行优化,以保证在后续中药配方中葛根的质量和疗效。丹参和三七也是心血管疾病常用的、活性成分作用比较明确的药物,这三种药材在治疗心脑血管的复方药物中配伍出现的频率高。因此,针对这三种药材配伍,建立单味药材的指纹图谱以期应用于其组方的中药复方制剂质量控制,建立多组分定性定量检测的快速液相(RRLC)分析方法。新开发的分析图谱可直接鉴定每一单味药材的成分分布,打破“丸散膏丹,神仙难辨”的局面,为中药复方的质量控制提供新的思路和方法。同时通过研究成分明确的葛根复方抗低密度脂蛋白基因敲除(LDL-R~(-/-))仓鼠动脉粥样硬化(AS)的效果,从而筛选出作用突出的药物配比。一.葛根提取物的制备工艺研究采用响应面法对葛根的提取工艺进行优化,主要考察因素为乙醇浓度(0-100%)、液料比(8-12倍)和提取时间(1-3h)等因素的影响,优化得到的最佳条件为乙醇浓度65%,液料比10.97倍,提取时间为3h,其中乙醇浓度和溶剂使用量对葛根主要异黄酮提取率有显著影响(p0.01),提取温度考察确定温度为80oC时提取效率最高。结合后续生产实际情况确定提取条件为乙醇浓度65%,液料比11倍,提取2次,第一次3h,第二次2h,提取温度80oC。大孔吸附树脂纯化葛根主要异黄酮的工艺考察,包含树脂的选择、上样量、上样速率、稀释倍数、径高比、冲洗用水量和洗脱用乙醇浓度及用量等因素。纯化工艺考察确定选用树脂AB-8;上样量为生药材:树脂量=1:2;径高比为1:6;上样液浓度为0.5g生药材/ml溶液;上样速度为3BV/h;上样完成后先用8BV纯化水洗脱,然后用70%乙醇洗脱7BV,收集洗脱液,干燥即得。二.RRLC用于葛根及复方的质量分析研究1.葛根RRLC一测多评法(QAMS)和特征图谱的建立选取葛根主要有效成分异黄酮成分3’-羟基葛根素、葛根素、葛根素6’’-O-木糖苷、3’-甲氧基葛根素、芹糖基葛根素和大豆苷等作为检测指标建立葛根及其提取物的RRLC分析方法,整个分析过程14min完成。通过配制6种成分不同浓度对照品溶液分别建立标准曲线,将葛根素标准曲线斜率与另外5种成分斜率的比值确定为各成分的相对校正因子,分别为1.253,1.422,1.297,1.332和1.030。后续检测仅需葛根素对照结合相对校正因子就可实现“一测多评”。比较“一测多评法”和常规方法测定样品其他5种成分的含量,偏差均小于1.5%。运用该方法测定了不同来源的38批葛根药材、6批粉葛药材和8批市售葛根提取物。其中1批葛根提取物中未检测出上述6种异黄酮类成分,对其余样品中6种成分标准化后的峰面积进行主成分(PCA)分析和统计分析。PCA分析可以直观地鉴别葛根和粉葛,同时通过样品的主成分1(PC1)的投影位置可以对葛根品质做出评价;统计分析显示葛根中的3’-羟基葛根素/葛根素(峰面积比)、3’-甲氧基葛根素/葛根素和芹糖基葛根素/葛根素在葛根中均大于0.1,而在粉葛中均小于0.1;葛根药材中3’-甲氧基葛根素/大豆苷和芹糖基葛根素/大豆苷几乎都在0.6及以上,而粉葛中刚好相反。各种成分的分布在葛根和市售的葛根提取物中较一致。同时采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004版对葛根及提取物和葛根对照药材共46批样品进行分析,共有峰有9个,相似度计算结果显示46批样品的RRLC图谱与对照指纹图谱的相似度计算结果均在0.96以上,表明各批次药材或提取物与对照指纹图谱具有很好的一致性。。2.葛根、丹参和三七复方多组分分析方法的建立和应用选取葛根中的3’-羟基葛根素、葛根素、3’-甲氧基葛根素、芹糖基葛根素和大豆苷,丹参中的丹酚酸B、隐丹参酮和丹参酮IIA,三七中的人参皂苷R_(g1)和人参皂苷R_(b1)作为质量控制指标建立葛根、丹参和三七复方多组分分析方法,进样后25min即可完成10种成分定性定量分析。0-6.5min洗脱出来的是葛根异黄酮类成分;6.5-14min为三七总皂苷和丹酚酸B;14-25min洗脱出来的是丹参酮类成分。将各单味药材的RRLC图谱轮廓(profile包含所含有的成分以及成分之间的比例关系等信息)在复方分析中得到很好地呈现。将该分析方法应用于葛根、丹参和三七三种提取物的成分测定、人参属植物(三七、人参和西洋参)的鉴别以及包含葛根、丹参和三七三种药材中成药制剂的检测,能有效评价相应药材及其复方制剂的质量。三.葛根、丹参和三七提取物复方抗LDL-R~((-/-))仓鼠AS的实验研究将成分明确的葛根、丹参和三七三种提取物通过不同配比添加饲喂用高脂饲料造模的低密度脂蛋白受体基因敲除LDL-R~((-/-))仓鼠,将70只仓鼠分为7组(包含模型组、阳性对照组和5个给药组),每组10只。在给药前、给药4周、给药8周和给药12周时眼眶取血,测定血清中的总胆固醇(TC)和总甘油三酯(TG),在给药12周后将老鼠处死,观察药物对LDL-R~((-/-))仓鼠主动脉全长以及主动脉根部管壁AS病变的影响。实验结果表明在给药周期内,三种提取物组成的不同配方对高脂饲喂LDL-R~((-/-))仓鼠血清中TC和TG从第8周到12周开始几乎均有降低趋势,且在给药12周后,相比模型组,给药组5(D:G:S=7:3:9)的TC和TG降低具有统计学意义;给药12周后,由三种提取物组成的不同配方能显著减轻LDL-R-/-仓鼠主动脉全长及主动脉根部的AS病变,抗AS作用最强的给药组配比为D:G:S=7:3:9。
【图文】：

二维图,交互作用,因素,使用量

图 1 任意两个因素之间的交互作用二维图由实验结果可知，软件优化的最佳条件为乙醇浓度为 65%，溶剂使用量为 10.97 倍，提取时间为 3 小时；因素 A（乙醇浓度）和因素 B（溶剂使用量）对提取率有极显著影响（p<0.01）。确定条件为乙醇浓度为 65%，溶剂使用量为 11 倍，提取 2 次，为了节省时间，将提取时间改为第一次3 h，第二次 2 h。2.3 温度对提取工艺的影响分别称取 10 g 葛根粉末，使用前述的优化条件分别在 60oC、70oC、80oC 水浴锅中提取（以提取液温度达到相应温度时开始计时），经稀释后进样检测结果见表 2：表 2 不同温度下的主要异黄酮提取量温度（oC） 60 70 80主要异黄酮提取量（mg/g 生药材）57.2 59.3 63.7

异黄酮,洗脱,树脂,葛根

min 振摇 10 s, 持续 2 h,分别吸取各解吸液稀释 100 倍后 0.22 μm 滤膜过滤，，取 1μL 进样。比洗脱量（mg 异黄酮/g 树脂）=洗脱液浓度 C3*洗脱液体积/树脂量比吸附率=比洗脱量/比吸附量*100%1.4 试验结果见表 3表 3 四种树脂对葛根主要异黄酮的静态吸附与洗脱结果（n=2）mg 主要异黄酮/g树脂HPD100 D101 HP20 AB-8比上样量 76.32 65.73 68.91 85.97比吸附量 61.13 50.26 53.53 71.03比洗脱量 53.81 43.95 49.16 63.60比吸附率 88.02% 87.44% 91.83% 89.53%
【学位授予单位】：湖北中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5

【参考文献】