基于ADME和Lipidomics探讨巴利森苷A-异钩藤碱组分中药对偏头痛模型大鼠的作用

发布时间：2020-04-04 19:45

【摘要】：天麻(Rhizoma Gastrodiae)和钩藤(Ramulus Uncariae cum Uncis)是中医临床上常用的药对,具有平肝潜阳、熄风止痉之功效,常配伍用于治疗血管性、肝阳上亢型偏头痛。组分中药是指从复方中各层次药效物质配伍研发的组分中药新药,由张伯礼、王永炎两位院士在2005年率先提出,目前已成为中药方剂配伍研究的热点。巴利森苷A和异钩藤碱(PI)分别是从天麻和钩藤中提取出来的活性单体成分,课题组前期研究证明,两者均为天麻钩藤药材中的主要入血成分,研究中同时发现,该成分联合给药对偏头痛模型大鼠具有药理活性作用。本课题组目前正在探讨能否用单体成分PI配伍来代替单味药天麻及钩藤的配伍。由于组分中药的可控性更强,且有可能达到服用剂量更小、药效更明确、毒性更可控的目的,具备进一步研究开发新药的可能性,具有较大的研究价值。然而组分中药配伍的机理尤其是体内过程评价是目前研究中必须要解决的关键问题。PI在体内的代谢过程是怎样的,联合给药较单独给药的优势是什么,其在体内是如何分布的,影响了体内哪些与偏头痛相关的内源性成分?这些都是PI组分中药进一步开发和临床应用的关键性问题。本文主要从ADME(药物进入体内后的过程)和脂质组学(药物影响内源性成分的变化)两方面内容研究PI组分中药对偏头痛模型大鼠的作用,以期为PI的新药研发奠定基础。1.生物样品中PI的LC-MS测定方法的建立为快速准确地分析生物样品中的PI的含量,本研究建立了两套完整的生物分析方法。采用AB Sciex Triple Quad?4500中的MRM模式对样品中的化合物进行定量检测,正离子模式下,以盐酸吡格列酮(m/z 357.1-134.1)作为内标同时检测异钩藤碱(m/z 384.8-241.2)及其代谢物钩藤碱(m/z 384.8-160.2),负离子模式下,以栀子苷(m/z 433.0-225)作为内标同时检测巴利森苷A(m/z 995.1-726.9)及其代谢物天麻素(m/z 331.1-123.0)。采用COSMOSIL C18(2.1 x 100 mm,2.6μm)色谱柱和0.1%甲酸水-乙腈的梯度运行对样品进行分离。该方法可获得优美对称的峰形,且仪器响应强度较好。方法学验证结果显示:该方法具有良好的线性关系(正离子方法:r0.9978;负离子方法:r0.9992),日间日内准确度在和精密度在可接受范围内(正离子方法:0.09RE6.50,1.50RSD8.39;负离子方法:0.08RE7.08,2.24RSD6.87),基质效应结果证明该方法不受生物样品中的基质的影响(正离子方法:3.74RSD11.52;负离子方法:1.71RSD8.59)且具有良好的提取回收率(正离子方法:2.93RSD6.98;负离子方法:2.30RSD7.17),满足长期、短期、及反复冻融的稳定性要求(正离子方法:1.91RSD11.36;负离子方法:1.04RSD7.70)。2.PI不同剂量给药的药代动力学对比研究为阐明PI在大鼠体内的代谢过程,以及不同给药剂量下在大鼠体内的代谢特征,采用高(异钩藤碱:巴利森苷A=60:558.6 mg/kg)、中(异钩藤碱:巴利森苷A=40:372.4 mg/kg)、低(异钩藤碱:巴利森苷A=20:186.2 mg/kg)三种不同的给药量对大鼠进行灌胃给药。采用DAS 3.2.8软件对不同时间点的化合物的血药浓度数据进行处理,拟合的药代动力学参数,另外采用Sigma Plot 10.0进行药-时曲线图进行绘制。结果显示在不同的给药剂量下,各化合物药-时曲线下面积(AUC(0-t))和达峰浓度(C max)呈现明显的正相关关系。对于异钩藤碱和钩藤碱,两者的半衰期(t1/2z)、达峰时间(Tmax)相近且药-时曲线的趋势相似。对于巴利森苷A和天麻素,巴利森苷A存在明显的双峰现象,提示该化合物在体内存在肝肠循环过程,从天麻素的AUC(0-t)值可以看出,巴利森苷A在大鼠体内极大程度地代谢成了天麻素,两者的t1/2z和Tmax值也很接近。3.PI单独与联合给药在偏头痛模型大鼠体内的药代动力学对比研究为进一步阐明PI在偏头痛模型大鼠体内的代谢过程,以及联合给药较单独给药的优势,本章以偏头痛模型大鼠为对象,采用单独给药和联合两种不同给药方式对其进行处理。实验结果显示在两种不同的给药模式下,各个化合物的代谢显示出较大的差异,在联合给药方式下,异钩藤碱及其体内的代谢物钩藤碱的AUC(0-t),t1/2z均显著大于单独给药,提示联合给药能促进异钩藤碱进入血液,增长其半衰期,延长其药效时间。此外在对巴利森苷A和天麻素的研究中发现,在单独给药方式下,巴利森苷A在血液中几乎检测不到,联合给药下检测到的量也是十分微小的,而其代谢物天麻素在血浆中的含量较高,并且在联合给药的方式下,其AUC(0-t)和t1/2z均大于单独给药,提示着巴利森苷A进入血液中可能主要通过转化为天麻素发挥药效,并且联合给药的方式能促进其在体内发挥药效。4.PI在正常和偏头痛模型大鼠体内的组织分布对比研究为研究PI在大鼠体内的分布情况,以及在正常大鼠体内和偏头痛模型大鼠体内的分布差异,以中剂量给予PI后,对给药后的0.5h,1h和6h大鼠的心、肝、脾、肺、肾、小肠和脑中的药物浓度进行检测。结果表明:异钩藤碱和钩藤碱在各个组织中都有分布,异钩藤碱主要是在脑组织、肾组织和肺组织中分布较高而钩藤碱主要是在肝、脾和小肠中分布较多。巴利森苷A和天麻素主要分布在小肠中,其它组织中含量较少甚至几乎没有检测。通过比较正常组和模型组中PI在脑组织中的分布,我们发现给药后1h,模型组中的异钩藤碱和天麻素的含量大于正常组,提示偏头痛病理状态可能促进该成分在靶组织中的分布。5.PI抗偏头痛的脂质组学研究为寻找偏头痛相关的脂生物标志物以及研究PI对偏头痛相关的脂内源性成分的调节作用,采用脂质组学技术对其进行研究。应用Dionex Ultimate 3000(UHPLC)Thermo Orbitrap Elite进行相关脂质成分的检测,采用Waters UPLC○R BEH C18(1.7μm 100*2.1mm)色谱柱进行分离。经Agilent Masshunter Qualitative Analysis B.08.00软件和R软件平台下的XCMS程序包处理后结合SIMCA-P13.0和SPSS statistics 21软件对数据进行分析。结果共鉴定16个重要的脂生物标志物,分别为磷脂酰胆碱(PC)类,溶血磷脂酰胆碱(LPC)和磷脂酰乙醇胺(LPE)类,以及鞘脂类的神经酰胺(Cer)和鞘磷脂(SM))。同时证明PI对偏头痛相关的内源性脂质成分具有明显的调节作用。
【图文】：

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图 1 巴利森苷 A 在大鼠体内的代谢途径Figure 1 Metabolic pathway of parishinAin rats图 2 异钩藤碱在大鼠体内的代谢途径Figure 2 Metabolic pathway of isorhynchophylline in rats

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8图 2 异钩藤碱在大鼠体内的代谢途径Figure 2 Metabolic pathway of isorhynchophylline in rats结麻和钩藤在我国有着悠久的药用历史，临床上常将其进行配伍使用伍方剂天麻钩藤饮常被用于治疗偏头痛等症。但目前的现状是中药作用靶点多，有效物质不明确等，这些缺点限制了中药的应用和发为天麻钩藤的主要活性成分，资源丰富易得，活性物质清晰明确，有价值，若能将其体内代谢过程和药效作用机制阐明，将会为其新药上的支持。
【学位授予单位】：江西中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5

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