五酯胶囊及其质控成分五味子甲素抗胆汁淤积性肝损伤的作用研究

发布时间：2020-04-04 23:06

【摘要】：研究目的胆汁淤积,指的是肝细胞或者胆管内的胆汁的生成和外排受阻,导致肝脏和体循环中的胆汁酸,胆固醇和胆红素等胆汁成分过度积累,从而损伤肝细胞。临床上大多数药物具有肝损伤的药物副作用,药物性肝损伤又分为细胞性肝损伤,胆汁淤积性肝损伤和混合型肝损伤,其中胆汁淤积性肝损伤是现代临床上较为常见的病种,其发病机制较为复杂,而目前临床上治疗胆汁淤积性肝损伤的药物十分有限。根据临床报道和前期工作,我们推测五酯胶囊和五味子甲素可拮抗利福平诱导的胆汁淤积性肝损伤。因此,本课题采用利福平构建胆汁淤积性肝损伤的模型,在体内和体外对五酯胶囊及其质控成分五味子甲素的保肝作用机制进行研究,为临床上开发治疗胆汁淤积性肝损伤的药物提供理论和实验依据。研究方法1.动物水平研究五酯胶囊和五味子甲素抗胆汁淤积性肝损伤的作用及其机制建立利福平致大鼠胆汁淤积性肝损伤模型,并从四个方面进行评价:①血清ALT、AST、ALP、TB、DB和TBA等胆汁淤积性肝损伤相关生化指标;②肝组织病理检查,对大鼠肝脏病理切片进行评估;③提取蛋白,Western blotting法测定MRP2、BSEP和PXR的蛋白表达;④提取RNA,实时荧光定量PCR测定MRP2、BSEP和PXR的mRNA水平。通过灌胃给与五酯胶囊和五味子甲素高、中、低三个剂量,并设置阳性对照组(熊去氧胆酸给药),从血清生化指标、病理切片、蛋白表达和mRNA水平四个方面评价五酯胶囊和五味子甲素对利福平致大鼠胆汁淤积性肝损伤的对抗作用。2.细胞水平研究五酯胶囊及其质控成分五味子甲素抗胆汁淤积性肝损伤的作用及其机制以HepG2细胞为研究对象,体外给予系列浓度利福平,通过细胞上清ALT、AST、TB、DB等胆汁淤积性肝损伤相关指标的变化,构建胆汁淤积性肝损伤的细胞模型。在胆汁淤积性肝损伤细胞模型中,从相关肝损伤生化指标、相关蛋白(MRP2、BSEP和PXR)表达和mRNA水平三个方面评价五酯胶囊和五味子甲素对利福平致胆汁淤积性肝损伤的作用及其机制。采用本课题组前期慢病毒干扰RNA技术沉默细胞PXR基因的沉默细胞株,与HepG2正常细胞组对比,从相关肝功能生化指标、相关蛋白的表达和mRNA水平三个方面探讨PXR通路在五酯胶囊和五味子甲素对抗利福平致胆汁淤积性肝损伤中的所起的作用。结果1.每日灌胃一次剂量100mg/kg的利福平,在给药一周后有明显的致胆汁淤积的效果,与空白对照组相比,模型组大鼠血清的AST、TB、DB、TBA等肝功能指标明显上升(尸0.01),血清中的ALT和ALP无明显改变(P0.05)。肝脏病理切片HE染色显示,模型组的大鼠肝组织有明显的炎症细胞浸润,并伴有胆汁横流和胆管受损。与利福平诱导的模型组相比,高剂量的五酯胶囊和五味子甲素给药组显著降低了大鼠血清中的AST、TB、DB、TBA等肝损伤指标含量(P0.001),肝脏病理分析也相对模型组有所改善。模型组大鼠的MRP2、BSEP和PXR蛋白和mRNA水平显著下降,各治疗组大鼠的相关蛋白和mRNA水平显著升高,并且呈剂量依耐性。2.细胞实验结果显示:利福平在正常HepG2细胞和沉默细胞中,均能导致明显的肝损伤,且DB、TB上升明显(P0.01),AST、ALT无显著性差异,提示利福平所致肝损伤为胆汁淤积性肝损伤。给与五酯胶囊后的肝损伤细胞,经检测蛋白表达,发现PXR及相关调控蛋白下调,mRNA的水平也有所下降。并且经过五酯胶囊处理的细胞明显降低了细胞的肝功能生化指标,相应的蛋白也有所上调,但是,五味子甲素的给药在细胞水平并无明显差异。结论五酯胶囊及其质控成分五味子甲素对利福平诱导的胆汁淤积肝损伤具有保护作用,结合体内外的研究发现,五酯胶囊的保肝机制可能是通过核受体PXR调节胆汁酸转运体MRP2和BSEP功能改变从而调节胆汁转运体功能实现的,并且其作用可能还与其他核受体有关。
【图文】：

五味子甲素,生化指标,肝损伤,大鼠

通过检测各组大鼠的血清肝功能生化指标可以发现利福平能够引起明显的逡逑肝损伤，模型组大鼠与对照组相比，谷草转氨酶（ＡＳＴ）、直接胆红素（ＤＢ）、逡逑总胆红素（ＴＢ）和总胆汁酸（ＴＢＡ）的水平显著升高（如图１－１邋Ａ，邋Ｃ，邋Ｄ，，Ｆ）。逡逑然而，谷丙转氨酶（ＡＬＴ）和碱性磷酸酶（ＡＬＰ）的水平没有显著差异（图１－１邋Ｂ，逡逑Ｅ），提示利福平给药可诱导大鼠产生肝损伤，并且所引起的肝损伤是胆汁淤积逡逑性肝损伤而非细胞性肝损伤。如图２－１所示，灌胃不同剂量的五酯胶囊和五味子逡逑甲素可显著抑制ＡＳＴ，ＤＢ，邋ＴＢ和ＴＢＡ的水平，且五酯胶囊的作用与剂量呈正逡逑相关。与模型组进行比较，五酯胶囊高剂量组（３２０ｍｇ／ｋｇ）和五味子甲素各剂逡逑量组处理的大鼠ＴＢＩＬ

五味子甲素,蛋白表达,大鼠,给药

１．邋５．邋５五酯胶囊及五味子甲素对５５职和Ｐ”？邋ｍＲＮＡ表达水平的影响逡逑用每组的大鼠的肝脏样品中提取的总ＲＮＡ作为ＰＣＲ扩增的模板，用于逡逑ＱＲＴ－ＰＣＲ。结果如图１－５所示，模型组大鼠的尸规召见户和Ｍ兄Ｐ２的ｍＲＮＡ逡逑水平显著低于对照组（Ｐ０．００１），与模型组相比，中剂量（２４０ｍｇ／ｋｇ）和高剂逡逑量（３２０ｍｇ／ｋｇ）的五酯胶囊给药使大鼠的相关基因５Ｓ五Ｐ和Ｍ／？Ｐ２ｍＲＮＡ逡逑水平显著升高（Ｐ＜０．０１）。五味子甲素给药组和五酯胶囊组对利福平致大鼠的胆逡逑汁淤积性肝损伤治疗具有相似的作用，且基本呈剂量相关性。逡逑２０逡逑
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R284;R285.5

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