丹栀逍遥散通过凋亡途径抗乳腺癌及其分子机制的研究

发布时间：2020-04-06 08:20

【摘要】：目的:本实验基于乳腺癌肝郁生热、脾虚血弱的中医基本病机,选取疏肝健脾、养血清热的经典方剂丹栀逍遥散,从凋亡的角度出发,探讨丹栀逍遥散抗乳腺癌的作用及其机制,揭示了丹栀逍遥散可能通过调控乳腺癌细胞凋亡的途径抗乳腺癌。材料与方法:6周龄SPF级BALB/c-nu雌性裸鼠32只,适应性喂养7d后,将密度为1×10~8/mL的MCF-7细胞悬液接种于裸鼠腋窝处皮下,接种10d后造模成功。将成模后的裸鼠随机分为4组,分别为模型组、丹栀逍遥散高剂量组(17.98g·kg~(-1))、中剂量组(8.99g·kg~(-1))和低剂量组(4.50g·kg~(-1)),各组n=8。术后给予灌胃处理,药物按人和小鼠体表面积换算等效的给药剂量的比值来计算灌胃量,按固定的时间灌服2次/d,连续给药15d,模型组给予等量的生理盐水。末次给药1h后,脱颈椎处死裸鼠,剥离裸鼠的腋窝处皮下肿瘤组织。称取新鲜的裸鼠肿瘤瘤体质量,计算质量抑制率。采用苏木素和伊红(HE)染色法观察裸鼠移植瘤组织的形态学改变。Tunel染色法检测肿瘤组织细胞凋亡。免疫印迹法(Western blot)检测肿瘤组织中凋亡蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3和Cyt-c的表达。制备丹栀逍遥散中剂量组含药血清。细胞分组:MCF-7细胞分为两组,分别为空白血清组和丹栀逍遥散中剂量含药血清组。采用MTT(噻唑蓝)比色法测定MCF-7细胞的增殖率,其中含药血清体积分数分别为10%、15%、20%,干预时间分别为12h、24h、48h、72h。采用流式细胞术分析MCF-7细胞周期、凋亡。采用吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)染色法观察MCF-7细胞凋亡。采用罗丹明123(Rh 123)荧光染色法观察MCF-7细胞内线粒体膜电位的变化。采用Western blot法检测MCF-7细胞内凋亡蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3和Cyt-c的表达。结果:1.丹栀逍遥散对MCF-7裸鼠移植瘤的影响肿瘤质量抑制率结果显示,与模型组比较丹栀逍遥散高、中剂量组对MCF-7裸鼠移植瘤的质量抑制率为29.89%(P0.05)、47.89%(P0.01),低剂量组与模型组无明显差异。HE染色结果显示,与模型组比较,丹栀逍遥散高、中剂量组肿瘤组织坏死灶显著增加,胞浆淡染,其中中剂量组效果最为显著,低剂量组与模型组无明显差异。Tunel染色法结果表明,相比模型组,丹栀逍遥散高、中剂量组的肿瘤组织细胞凋亡率为22.45±7.55%(P0.05)、30.41±10.01%(P0.01),低剂量组与模型组无明显差异。由于在肿瘤质量抑制率测定、HE染色法、Tunel染色法中,丹栀逍遥散低剂量组与模型组的实验结果均无明显差异,所以丹栀逍遥散低剂量组不纳入后续的Western Blot实验中。Western blot法结果表明,丹栀逍遥散高剂量组上调凋亡蛋白Bax(P0.01)、Cyt-c(P0.01)的表达,下调凋亡蛋白Bcl-2(P0.01)的表达;丹栀逍遥散中剂量组上调凋亡蛋白Bax(P0.01)、Caspase-3(P0.01)、Cyt-c(P0.01)的表达,下调凋亡蛋白Bcl-2(P0.01)的表达,其中丹栀逍遥散中剂量组效果优于高剂量组。2.丹栀逍遥散含药血清对MCF-7细胞的影响MTT法结果显示,与空白血清组比较,15%含药血清组处理细胞12h、24h、48h、72h后,细胞的增殖能力明显减弱(P0.05),其中15%含药血清组处理细胞48h后效果最为显著。其余各组相比空白血清组均没有明显差异(P0.05)。因此,选取血清体积分数为15%、干预时间为48h作为后续实验的干预条件。AO/EB染色结果显示,与空白血清组比较,丹栀逍遥散中剂量含药血清组作用于MCF-7细胞48h后,大部分细胞呈绿色深染荧光,溴化乙锭标记的带有红色荧光的肿瘤细胞数量显著增加。流式细胞术结果表明,相比空白血清组,丹栀逍遥散中剂量含药血清干预MCF-7细胞48h后,细胞凋亡率上调至19.51%,空白血清组与丹栀逍遥散中剂量含药血清组G1期细胞比例分别为42.83%、51.98%,S期细胞比例分别为54.23%、46.79%,与空白血清组比较,丹栀逍遥散中剂量含药血清组的细胞合成前期比例明显升高,合成期明显减少。Rh 123荧光染色结果显示,与空白血清组比较,丹栀逍遥散中剂量含药血清组细胞线粒体膜电位明显减低。Western blot法结果表明,丹栀逍遥散中剂量含药血清组上调凋亡蛋白Bax(P0.01)、Caspase-3(P0.01)、Cyt-c(P0.01)的表达,下调凋亡蛋白Bcl-2(P0.01)的表达。结论:1.丹栀逍遥散可能通过诱导肿瘤组织细胞凋亡的途径抑制肿瘤的生长,且最佳给药剂量为中剂量(8.99g·kg~(-1))。2.丹栀逍遥散诱导肿瘤细胞凋亡可能与上调Bax、Caspase-3、Cyt-c的表达,下调Bcl-2的表达有关3.丹栀逍遥散中剂量含药血清可诱导乳腺癌细胞MCF-7凋亡,其最佳工作浓度为15%血清体积分数,最佳作用时间为48h。4.丹栀逍遥散中剂量组含药血清可能通过线粒体介导的凋亡途径诱导乳腺癌细胞MCF-7凋亡。5.凋亡因子Bcl-2、Bax作用于线粒体后,调控线粒体通透性转变孔(mPTP)的异常打开,从而导致线粒体膜电位降低,向细胞质内释放凋亡因子Cyt-c,从而激活细胞内的Caspase-3,引发一系列的级联反应,最终诱导细胞凋亡,这可能是丹栀逍遥散诱导细胞凋亡的基本分子机制之一。
【图文】：

图 1-1 各组肿瘤组织的细胞形态（200×）模型组；B：丹栀逍遥散高剂量组；C：丹栀逍遥散中剂量组；D：丹栀逍遥散剂量组逍遥散对肿瘤组织细胞凋亡率的影响nel 染色法结果显示，凋亡细胞的细胞核呈现棕褐色，模型组中可见有少量细棕褐色。与模型组比较，丹栀逍遥散高、中剂量组中，有大量肿瘤组织细胞的染成棕褐色不均匀散在分布，且肿瘤组织细胞凋亡率显著提高（P＜0.01）。散低剂量组与模型组无明显差异。其中丹栀逍遥散中剂量组效果最为显著见表 1-2。表 1-2 各组肿瘤组织细胞的凋亡率（ x±s，n=3）别 剂量（g·kg-1） 细胞凋亡率(％)

图 1-2 丹栀逍遥散对肿瘤组织细胞凋亡的影响（400×）A：模型组；B：丹栀逍遥散高剂量组；C：丹栀逍遥散中剂量组；D：丹栀逍遥散低剂量组4 丹栀逍遥散对肿瘤组织凋亡蛋白表达的影响4.1 丹栀逍遥散高剂量组对肿瘤组织相关凋亡蛋白表达的影响结果显示，与模型组比较，，丹栀逍遥散高剂量组显著上调凋亡蛋白 Bax（P＜0.01）、Cyt-c（P＜0.01）的表达，显著下调凋亡蛋白 Bcl-2（P＜0.01）的表达。模型组与丹栀逍遥散高剂量组中的凋亡蛋白 Caspase-3 表达无明显差异（P＞0.05）。见表 1-3，图1-3。4.2 丹栀逍遥散中剂量组对肿瘤组织相关凋亡蛋白表达的影响结果显示，与模型组比较，丹栀逍遥散中剂量组显著上调凋亡蛋白 Bax（P＜0.01）、Cyt-c（P＜0.01）、Caspase-3（P＜0.01）的表达，显著下调凋亡蛋白 Bcl-2（P＜0.01）
【学位授予单位】：辽宁中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5

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本文编号：2616260