苦参碱通过增强自噬改善顺铂诱导的肾小管上皮细胞损伤的研究

发布时间：2020-04-09 16:02

【摘要】：目的建立顺铂诱导的大鼠肾小管上皮(NRK-52E)细胞损伤体外模型,评价苦参碱在顺铂诱导的肾小管上皮细胞毒性损伤中的保护作用。通过对自噬相关监测指标的检测,进一步探讨细胞自噬与苦参碱改善顺铂诱导的NRK-52E细胞损伤机制之间的关系。方法(1)体外培养大鼠肾小管上皮细胞株,建立苦参碱和顺铂单独或共同干预NRK-52E细胞模型。CCK-8法分别测定不同浓度的顺铂(0、5、25、50、75、100μmol/L)处理NRK-52E细胞24h后细胞的损伤情况,CCK-8法分别测定不同浓度的苦参碱(0、0.01、0.1、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/ml)处理NRK-52E细胞24h后NRK-52E细胞的生存状况。根据NRK-52E细胞的生存率的改变,选定顺铂及苦参碱的有效作用浓度,设置三个实验分组:正常对照组、顺铂组、苦参碱+顺铂组;通过普通光学显微镜观察细胞形态的改变并拍照,同时各实验分组采用CCK-8法和乳酸脱氢酶(LDH)活性测定法确认细胞生长存活状况及损伤情况。(2)根据实验(1)确定的顺铂和苦参碱干预浓度以及实验分组情况,建立苦参碱干预顺铂诱导的NRK-52E细胞损伤模型。在透射电子显微镜下观察NRK-52E细胞的超微结构以及自噬体的形成情况;采用实时荧光定量PCR法(Real-time PCR法)检测自噬标志蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)mRNA的相对表达水平;Western Blot法测定NRK-52E细胞内LC3-Ⅰ及LC3-Ⅱ蛋白的表达情况;细胞免疫荧光法观察LC3、p62蛋白的荧光表达情况。结果(1)与正常对照组相比,顺铂组细胞形态学变化明显,细胞出现胞体萎缩、变圆等损伤甚至老化死亡情况,且NRK-52E细胞存活率明显下降,并随着顺铂浓度的增加,呈现明显的浓度依赖性,提示顺铂诱导的肾小管上皮细胞损伤模型建模成功。与正常对照组相比,CCK-8法和乳酸脱氢酶(LDH)活性测定结果显示顺铂组细胞存活率明显下降(P0.05),细胞毒性损伤明显上升(P0.05);与顺铂组相比,苦参碱干预后明显改善顺铂诱导的细胞老化死亡情况,CCK-8法和乳酸脱氢酶(LDH)活性测定结果亦显示NRK-52E细胞生存力显著提高(P0.05),细胞毒性损伤明显降低(P0.05)。(2)透射电子显微镜观察显示,正常对照组NRK-52E细胞胞质内线粒体、内质网等细胞器结构清晰可见;顺铂组线粒体、内质网等肿胀变形,胞质内可见自噬体;苦参碱组明显可见大量清晰的双层膜结构样的自噬体,其内可见部分未消化完全的破损细胞器。与正常对照组相比较,顺铂组:自噬相关蛋白相对定量显示,LC3 mRNA及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达相对上调(P0.05),LC3蛋白免疫荧光标记检测结果显示出颗粒状亮点,而p62蛋白荧光强度表现出减弱趋势,提示顺铂可诱导细胞自噬水平上调;与顺铂组相比较,苦参碱+顺铂组:NRK-52E细胞中自噬相关基因LC3 mRNA表达进一步上调(P0.05),相应地LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达比值进一步增强(P0.05),LC3蛋白免疫荧光标记检测呈现出明显的团块状荧光聚集现象,而p62蛋白荧光显著减弱,提示苦参碱进一步上调了顺铂诱导的细胞内自噬水平。结论苦参碱可改善顺铂诱导的肾小管上皮细胞损伤,该作用可能与其上调细胞自噬有关。
【图文】：

噬改善顺铂诱导的肾小管上皮细胞损伤的研究 20择合适浓度的顺铂诱导 NRK-52E 细胞毒性损伤模型浓度的顺铂处理 NRK-52E 细胞 24 h 后细胞存活率 所示，不同浓度顺铂刺激 NRK-52E 细胞 24 h 后，对均产生了不同程度的抑制。顺铂浓度为 0、5、25、，NRK-52E 细胞存活率依次为 99.97%、94.19%、77.2.76%。与正常对照组相比较，加入不同浓度顺铂处，，NRK-52E 细胞活力出现了明显下降，差异具有统随着顺铂浓度的增加，呈现出显著的浓度依赖性生测结果选择50μmol/L的顺铂浓度作为后续试验中型的干预条件。（如下图 1-1）

噬改善顺铂诱导的肾小管上皮细胞损伤的研究 2参碱对细胞活性产生明显地抑制作用，差异具有统 1.0mg/ml 以内浓度的苦参碱对细胞活性未产生学意义（P＞0.05），即小于 1.0mg/ml 的浓度为苦据结果，后续实验选用 0.5mg/ml 的非细胞毒性E 细胞，用于评价对顺铂所致 NRK-52E 细胞损伤模
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5

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本文编号：2620970