基于PULs研究两个中药复方多糖竞争性调节拟杆菌生长的分子机制

发布时间：2020-04-11 07:15

【摘要】：目的:中药多糖是中药复方主要成份之一,中药多糖可调节肠道菌群结构,基于多糖利用位点阐述参苓白术散多糖和理中汤多糖调节肠道拟杆菌生长的分子机制,为不同中药复方多糖调节肠道菌群的不同方式提供现代证据。方法:1、将两株拟杆菌(多形拟杆菌、脆弱拟杆菌)、两株厚壁菌(厚壁菌YT2、厚壁菌T30)分别选取拟杆菌、厚壁菌各一株混合,形成四个组合(多形拟杆菌和厚壁菌YT2、多形拟杆菌和厚壁菌T30、脆弱拟杆菌和厚壁菌YT2、脆弱拟杆菌和厚壁菌T30),分别在复合碳源BHI培养基、参苓白术散多糖、理中汤多糖为唯一碳源的培养基上进行体外混合培养,在不同时间段连续取样,在不同中药复方多糖作为细菌碳源,检测不同组合中拟杆菌、厚壁菌的生长曲线,以获得不同多糖碳源对混合菌的碳源竞争的影响作用。2、对自行分离的两株厚壁菌(厚壁菌YT2、厚壁菌T30)采用第三代PacBio RSⅡ高通量测序平台进行全基因测序。分别对两株拟杆菌、两株厚壁菌的全基因组序列进行多糖利用位点分析,从多糖利用位点角度解释参苓白术散多糖和理中汤多糖调节肠道菌群的微生态结构的作用机制。同时对分解多糖能力较强的两株拟杆菌进行转录组数据分析。结果:1、四种不同组合的混合菌在不同碳源(BHI、参苓白术散多糖、理中汤多糖)环境下进行体外培养。对于多形拟杆菌和厚壁菌YT2组合,分别在(BHI、参苓白术散多糖、理中汤多糖)不同培养基环境下培养,在32 h、44 h、24 h混合细菌最高峰总浓度分别为(31.97±0.67)×10~8 CFU/ml、(11.17±0.13)×10~8 CFU/ml、(8.64±0.26)×10~8 CFU/ml;对于多形拟杆菌和厚壁菌T30组合,分别在(BHI、参苓白术散多糖、理中汤多糖)不同培养基环境下培养,在36 h、32 h、36 h混合细菌最高峰总浓度分别为(24.90±0.88)×10~8 CFU/ml、(14.74±0.36)×10~8 CFU/ml、(18.37±1.00)×10~8 CFU/ml;对于脆弱拟杆菌和厚壁菌YT2组合,分别在(BHI、参苓白术散多糖、理中汤多糖)不同培养基环境下培养,在32 h、44 h、32 h混合细菌最高峰总浓度分别为(62.07±1.26)×10~8 CFU/ml、(32.66±1.63)×10~8 CFU/ml、(27.46±1.53)×10~8 CFU/ml;对脆弱拟杆菌和厚壁菌T30组合,分别在(BHI、参苓白术散多糖、理中汤多糖)不同培养基环境下培养,在36 h、32 h、36 h混合细菌最高峰总浓度分别为(62.84±0.74)×10~8 CFU/ml、(37.22±1.39)×10~8 CFU/ml、(64.90±1.45)×10~8 CFU/ml。在参苓白术散多糖、理中汤多糖环境培养下:拟杆菌一直比厚壁菌生长更快;在BHI复合碳源环境培养下:厚壁菌生长前期快于拟杆菌,后期拟杆菌生长优于厚壁菌,且两种中药复方多糖对四种不同组合的混合菌调节存在差异。2、厚壁菌T30全基因组序列大小为5288332 bp,GC含量为35.35%,编码基因有5427个。厚壁菌T30具有2个基因簇,共识别了128个碳水化合物酶基因表达。厚壁菌YT2全基因组序列大小为3264034 bp,GC含量为28.76%,编码基因有3098个。厚壁菌YT2具有1个基因簇,共识别了79个碳水化合物酶基因表达。将两株拟杆菌与两株厚壁菌全基因组碳水化合物进行对比,发现多形拟杆菌拥有大量碳水化合物基因,多形拟杆菌有88个多糖利用位点,可利用淀粉蛋白质163种,多糖裂解酶15种以及糖苷水解酶226种;脆弱拟杆菌全基因组能够编码碳水化合物脂酶5种,多糖裂解酶3种,糖苷水解酶141种,糖苷转移酶83种,其中预测全基因组中多糖利用位点31个。厚壁菌T30已全部进行预测出71个多糖利用位点基因簇,其中明确含有碳水化合物基因的多糖利用位点共有47条。厚壁菌T30全基因组能够编码碳水化合物脂酶6种,糖苷水解酶20种,糖苷转移酶8种。厚壁菌YT2已全部进行预测出30个多糖利用位点基因簇,其中明确含有碳水化合物基因的多糖利用位点共有23条,其中够编码碳水化合物脂酶7种,糖苷水解酶14种,糖苷转移酶11种。拟杆菌具有多种不同的多糖利用位点,分解多糖能力很强;厚壁菌相对拟杆菌碳水化合物基因极少,且缺乏多糖利用位点识别基因对,分解多糖能力很弱,恰好与前文碳源竞争实验结论相对应,在多糖环境下培养,拟杆菌生长优于厚壁菌可能与多糖利用位点的多少相关。对于两株拟杆菌转录组数据分析发现,多形拟杆菌在参苓白术散多糖、理中汤多糖环境培养下,被显著表达的12个多糖利用位点中有10个多糖利用位点在理中汤多糖比参苓白术散多糖环境培养下更好的被表达出来;有2个多糖利用位点在参苓白术散多糖比理中汤多糖环境培养下更好的被表达出来。脆弱拟杆菌在参苓白术散多糖、理中汤多糖环境培养下,被显著表达的13个多糖利用位点中有11个多糖利用位点在理中汤多糖比参苓白术散多糖环境培养下更好的被表达出来;有2个多糖利用位点在参苓白术散多糖比理中汤多糖环境培养下更好的被表达出来。结论:拟杆菌与厚壁菌的混合菌在参苓白术散多糖、理中汤多糖为唯一碳源的培养基中培养,拟杆菌生长明显优于厚壁菌,拟杆菌更具有碳源竞争优势,且两种中药复方多糖对四种混合菌调节存在差异;通过全基因组碳水化合物对比,拟杆菌拥有多糖利用位点明显多于厚壁菌,拟杆菌分解多糖能力明显强于厚壁菌,与碳源竞争实验结论中拟杆菌更具有碳源竞争优势相符合,糖利用位点可能为参苓白术散、理中汤调节肠道菌群结构机制之一。且通过拟杆菌转录组数据分析,发现拟杆菌在参苓白术散多糖、理中汤多糖环境中多糖利用位点表达具有差异,以此证明,不同中药多糖可诱导典型肠道拟杆菌多糖利用位点的差异表达,这可能是不同中药复方以不同方式调节肠道拟杆菌的分子机制之一。
【图文】：

拟杆菌,解过程,多糖,活性酶

将低聚糖向 SusC 转运过程。多糖利用位点除了 SusC 和 SusD 蛋白，还包括其他外膜糖蛋白结合蛋白，编码碳水化合物活性酶的基因(Carbohydrate-Active enZymes，，CAZYmes)、反应调节剂和转运体，它们都有助于拟杆菌有效降解单个底物。其中利用位点降解何种多糖与碳水化合物活性酶基因表达功能上是相关的，但常被大片段未知功能基因区域分开，以便进行更好的调控[6]。

生长曲线,拟杆菌,厚壁,多形

本实验中混合菌的不同组合，其中所包括拟杆菌为革兰氏阴性菌、厚壁菌为革兰氏阳性菌，可以通过革兰氏染色很好的区分，显微镜下算出每个固定视野中拟杆菌、厚壁菌的数量比。3.3 细菌数量换算结果通过计数多形拟杆菌、脆弱拟杆菌、厚壁菌 YT2、厚壁菌 T30 平板上的细菌个数转换出 1 OD600所包含的细菌个数。其中 1 OD600多形拟杆菌有 49 × 108个细菌；1 OD60脆弱拟杆菌有 126 × 108个细菌；1 OD600厚壁菌 YT2 有 7.38 × 108个细菌；1 OD600厚壁菌 T30 有 2.35 × 108个细菌。3.4 参苓白术散多糖、理中汤多糖对拟杆菌和厚壁菌组合的竞争性结果3.4.1 参苓白术散多糖、理中汤多糖对多形拟杆菌和厚壁菌 YT2 竞争结果混合菌多形拟杆菌和厚壁菌 YT2 在不同碳源为培养基的混合培养情况下，观察拟杆菌、厚壁菌体外碳源竞争情况。混合菌多形拟杆菌和厚壁菌 YT2 在 BHI 培养基中培
【学位授予单位】：江西中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285

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