别欧前胡素通过激活MAPK信号通路诱导HL-60细胞凋亡

发布时间：2020-04-14 18:27

【摘要】：目的:别欧前胡素是一种从中草药白芷中提取出来的香豆素,研究发现中药白芷及其单体在多种癌症模型中均表现出抗肿瘤活性,如肺癌,胃癌,乳腺癌等,然而,据我们所知,别欧前胡素对HL-60细胞的作用及其机制尚未明确。本研究旨在探讨别欧前胡素对HL-60细胞的体外抗肿瘤作用及机制。方法:1.采用CCK-8和台盼蓝拒染法,明确别欧前胡素对HL-60细胞增殖能力的影响。2.采用流式细胞仪检测别欧前胡素对HL-60细胞凋亡及周期的影响。3.采用western blot及RT-PCR法检测在别欧前胡素诱导HL-60细胞凋亡过程中Bcl-2,Bax,cleaved-caspase8,-9,-3蛋白及Bcl-2,Bax mRNA的表达情况。4.采用Oncomine分析差异基因IARS2在AML患者骨髓及非AML患者骨髓中的表达情况。5.用Ualcan数据库分析,在AML患者骨髓中IARS2表达量的高低与患者生存率之间的相关性。6.采用Western blot及RT-PCR法验证差异基因IARS2在别欧前胡素组及DMSO组中的表达情况。7.采用微阵列分析,别欧前胡素组与DMSO组差异基因;8.用Western blot分析不同浓度及不同作用时间的别欧前胡素处理HL-60细胞后MAPK相关蛋白:P-JNK、JNK、P-P38、P38、P-ERK、ERK表达情况;并分别使用SP600125、SCH772984、SB203580抑制HL-60细胞中P-JNK、P-P38、P-ERK的表达,观察别欧前胡素作用后每组Cleaved-caspase3的表达情况,明确P-JNK、P-P38、P-ERK在别欧前胡素诱导HL-60细胞凋亡中的作用;9.别欧前胡素处理HL-60细胞后,HL-60细胞中PML-RARA的表达情况。结果:1.CCK-8检测结果提示别欧前胡素处理后的HL-60细胞增殖明显受限,且抑制作用随着用药浓度的增加逐渐增加,当药物浓度为50μg/ml时其抑制作用最明显;别欧前胡素作用后的HL-60细胞台盼蓝染色率增高。2.随着别欧前胡素用药浓度的增加,HL-60细胞的凋亡率明显增加,以晚期凋亡为主,将HL-60细胞阻滞于S期。3.RT-PCR的检测结果提示药物组BAX的表达较对照组明显增加,而抑制凋亡因子Bcl-2的表达受抑;Western blot检测结果与RT-PCR一致,且cleaved-caspase-8,-9,-3的蛋白表达显著增加。4.Oncomine数据库的分析表明,与非-AML患者的骨髓相比较,AML患者骨髓中的IARS2基因的表达明显增加(P=2.11E-4),IARS2表达越高患者的预后越差。5.Western blot及RT-PCR分析表明别欧前胡素处理后的HL-60细胞中IARS2蛋白及mRNA的表达逐渐减少,差异具有显著的统计学意义。6.微阵列分析提示,IARS2,IER3,HK3,ETV1,NTHL1,SOX4,PAOX在别欧前胡素组与DMSO组之间存在差异表达,且差异均具有显著的统计学意义;7.Western blot的分析结果提示P-JNK/JNK,P-ERK/ERK,P-P38/P38比值随着用药浓度的增加逐渐增加(P0.05),当P-ERK,P-P38的表达被抑制时,Cleaved-caspase-3的表达与单纯药物组比较明显下调;而抑制P-JNK的表达后,Cleaved-caspase-3的表达与别欧前胡素组相比无显著的差异;8.别欧前胡素处理HL-60细胞后,细胞内PML-RARA的表达明显下降。结论:1.别欧前胡素可抑制HL-60细胞增殖,并诱导凋亡;2.别欧前胡素主要通过死亡受体途径及线粒体途径诱导HL-60细胞凋亡;3.IARS2在AML患者骨髓中高表达,且IARS2表达量越高患者的预后越差;4.别欧前胡素可通过抑制IARS2的表达提高AML患者的生存率;5.ERK及P38 MAPK信号通路的激活在别欧前胡素诱导HL-60细胞凋亡的过程中起重要作用;6.别欧前胡素可诱导HL-60细胞进一步分化。
【图文】：

欧前胡素,相关蛋白,线粒体,细胞

图 3. 别欧前胡素处理后细胞后线粒体及死亡受体凋亡途径相关蛋白的表达。 a.用别欧前胡素（10,30,50μg/ ml）处理 HL-60 细胞 48 小时，对照组中的细胞用 DMSO处理 48h，用 Western blot 法检测 cleaved-caspase8，-9，-3，Bax，Bcl-2 的表达；b.用 50μg/ ml 别欧前胡素处理细胞（0h，24h，48h，72h）后，检测上述蛋白的表达；c.用不同浓度的药物处理后 Bax，Bcl-2 mRNA 的表达；d.别欧前胡素作用后胞质及线粒体中细胞色素 C 的表达情况。 *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001。3.4 别欧前胡素对 HL-60 细胞中 IARS2 基因表达的影响我们的前期研究表明沉默 IARS2 后，HL-60 细胞的增殖率明显下降[15]（图 4a），Oncomine（https://www.oncomine.org/）数据库分析在 AML 患者骨髓中 IARS2 基因的表达情况时，结果显示与正常组骨髓中 IARS2 的表达量相比 IARS2 在 AML 患者的骨髓中高表达[112]（图 4b），此结果通过了荟萃分析验证，其中，涉及 565 名 AML 患者和 80 名健康受试者的 Meta 分析显示，AML 患者骨髓中 IARS2 的表达明显高于正常人(图 4c)[113]。通过 Ualcan（http://ualcan.path.uab.edu/index.html）数据库分析 IARS2的表达水平与 AML 患者生存期之间关系的时发现，IARS2 高表达患者的生存时间明显低于 IARS2 中低表达患者（P = 0.038）（图 4d），说明下调 IARS2 基因的表达可

数据库分析,患者预后,欧前胡素

别欧前胡素通过激活 MAPK 信号通路诱导 HL-60 细胞凋亡果发现用不同剂量的别欧前胡素处理后，HL-60 细胞中 IARS2 蛋白和 mRNA 的表达显著降低（图 5a，，5b），同时我们用 50μg/ ml 别欧前胡素处理 HL-60（0h，24h，48h，72h），结果表明 IARS2 的蛋白表达逐渐降低（图 5c），Affymetrix Human Gene 1.0 ST平台用于基因表达谱分析，发现 IARS2 在药物组和空白对照组中表达差异有统计学意义，别欧前胡素作用后 IARS2 的表达明显下降，P <0.05，| FC | ≥1.5（图 5d）。
【学位授予单位】：陕西中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285

【参考文献】