半夏泻心汤对ICC凋亡相关蛋白和通路的影响

发布时间：2020-04-17 12:01

【摘要】：[目的]半夏泻心汤作为经典方剂,对于现代医学消化道疾病中的作用广泛。ICC作为近年来热门的间质细胞靶点被广泛研究,发现其在多种消化道疾病有积极参与。本课题组前期已经验证了半夏泻心汤在在体动物方面对ICC以及相关因子的影响。但是,胃肠道运动过程中涉及到的细胞和各种信号途径庞杂,涉及到ICC的相关分子机制尚不明确。本实验中研究从半夏泻心汤对于ICC的凋亡相关蛋白出发,探讨半夏泻心汤通过影响ICC的的凋亡来治疗“心下痞”的可能作用机制。[方法](1)制备半夏泻心汤含药血清:分组饲养大鼠,灌胃分别获取含药血清以及含有去离子水的动物血清;(2)分离培养新生BALB/C小鼠的胃ICC,免疫荧光双标c-kit蛋白、ANO1蛋白,鉴定细胞;(3)稳定培养细胞后,随机分为三组,空白组(含有胎牛血清)、含有去离子水的动物血清为正常对照组,半夏泻心汤药物血清组,用CCK8方法、流式细胞凋亡术检测各组对ICC增殖、凋亡率的影响;(4)采用ELISA酶联免疫吸附法检测各组细胞上清中eNOS内皮一氧化氮合酶表达;生化法检测一氧化氮NO含量;(5)采用western blot蛋白免疫印迹法检测各组SCF蛋白、c-kit蛋白、Bcl-2蛋白、Bax蛋白、caspase3蛋白、NF-kB蛋白、PI3K蛋白表达情况;(7)采用实时荧光定量法,检测半夏泻心汤对各组SCFmRNA、c-kitmRNA、Bcl-2mRNA、Bax mRNA、caspase3mRNA、NF-kBmRNA、PI3KmRNA表达影响。[结果](1)细胞鉴定:采用免疫荧光显微镜鉴定得到了细胞的c-kit蛋白阳性表达和ANO1蛋白阳性表达。(2)不同组别间ICC活力对比:与空白组、正常组相比,半夏泻心汤组对ICC的增殖无明显影响(P0.05);24h的时候,半夏泻心汤组的细胞活力达到顶值。(3)细胞凋亡率:与空白组(7.667±1.699)、正常组(6.3±2.317)相比,含药组5%低浓度组(5.983±1.665)(P0.05)无明显差异;含药组10%中浓度组(4.733±1.397)显著降低,(P0.05)差异有统计学意义;含药组15%高浓度组(5.35±1.139)(P0.05)无明显差异。(1)生化法(酶比色)和ELISA法检测细胞上清中NO和eNOS表达:各组NO表达对比:与空白组NO(45.88±11.89),含药组NO(25.81±6)表达降低,(P=0.0010.05)差异明显,有统计学意义,与正常组NO(47.04±5.21)(P0.05)差异有统计学意义;空白组与正常组相比,(P0.05)差异无统计学意义。各组eNOS表达对比:与空白组eNOS(56.49±23.09)相比,含药组eNOS(28.43±13.25)表达减少,(P=0.020.05)差异有统计学意义,与正常组eNOS(56.16±19)相比,含药组eNOS表达减少,(P=0.020.05)差异有统计学意义;正常组与空白组相比(P0.05)差异无统计学意义。(2)Western blot检测ICC凋亡相关蛋白表达:与空白组相比,正常组各蛋白表达P值均大于0.05,差异无统计学意义;含药组c-kit蛋白表达(P=0.280.05)差异无统计学意义,含药组NF-κB(P=0.0740.05)差异无统计学意义,其余各组蛋白表达均有明显差异。与正常组相比,含药组c-kit蛋白表达(P=0.2120.05)差异无统计学意义,含药组NF-κB(P=0.0640.05)差异无统计学意义,其余各组蛋白与正常组相比均有明显差异。(3)实时荧光定量检测ICC凋亡相关基因表达:空白组设置为参照组,CT值设为1。含药组c-kit(2.304±0.378)与正常组(1.711±0.382)相比,(P0.05)差异显著,有统计学意义;Bcl-2(1.416±0.204)与正常组(0.819±0.257)相比,(P0.05)差异显著,有统计学意义;含药组SCF(1.253±0.372)与正常组(0.869±0.376)相比,(P0.05)无统计学意义;含药组Bax(1.108±0.397)与正常组(1.428±0.111)相比,(P0.05)差异显著,有统计学意义;含药组caspase3(1.359±0.385)与正常组(1.921±0.243)相比,(P0.05)差异显著,有统计学意义;含药组PI3K(1.003±0.152)与正常组(1.626±0.292)相比,(P0.05)差异显著,有统计学意义;含药组NF-κκBp65(0.896±0.273)与正常组(1.419±0.339)相比,(P0.05)差异显著,有统计学意义。[结论](1)半夏泻心汤抑制ICC凋亡,24h,10%浓度的半夏泻心汤全方的SD大鼠半夏泻心汤含药血清培养明显有利于抑制ICC凋亡。(2)半夏泻心汤对于ICC分泌eNOS、NO有明显抑制作用。(3)半夏泻心汤可以促进ICC SCF、Bcl-2蛋白的表达,减少ICC的caspase3、Bax、PI3K表达;上调ICC的c-kit、Bcl-2 基因表达,下调ICC的caspase3、NF-κ Bp65、PI3K、Bax基因表达。(4)综上,半夏泻心汤对ICC凋亡相关的蛋白和基因有一定影响,初步探讨可能与SCF/C-kit信号通路和PI3K、NO信号通路协同作用有一定相关性,信号通路之间的具体协同机制需要进一步深入研究,半夏泻心汤对胃肠道运动的调节可能与抑制ICC凋亡有密切相关性。
【图文】：

ＮＯ邋ｒｅｃｐｔｏｒ图２邋ＩＣＣ、平滑肌细胞和相关神经系统的分布图Ｍ逡逑ＣＣ的慢波活动与离子通道的关系逡逑细胞间进行信息传递除了依靠电活动以外，还需要依靠多种物质，包括激素、神经逡逑

逑细胞与细胞间开始有了连接，为避免细胞过度生长重叠影响观察，加入ｌｍｌ的０．２５％的逡逑含有（ＥＤＴＡ）的胰酶消化，１０００ｒ／ｍｉｎ，５ｍｉｎ离心传代（图１－１Ｄ）；第二周时，镜下逡逑观察到ＩＣＣ突起大量延长交叉相连形成类似于平滑肌的长条形，，初级分支下开始有次逡逑级分支，且成网状结构，但是细胞数目开始变少，平滑肌细胞数目继续增多（图１－１Ｅ）；逡逑细胞培养至三周左右时细胞体积明显缩小，ＩＣＣ网状结构萎缩，边界不清，形态模糊。逡逑平滑肌样细胞并未继续增多（图１－１Ｆ）逡逑■逡逑ＳＢ逡逑图丨－丨不同时间段丨ＣＣ形态（倒置显微镜Ｘ２００）逡逑３．３细胞鉴定逡逑３．３．１原代ＩＣＣ鉴定逡逑３０逡逑
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5

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本文编号：2630839