阳春砂单萜和倍半萜合酶的功能鉴定及BPPS的功能比较

发布时间：2020-05-09 22:25

【摘要】：1.目的中药材砂仁具有化湿开胃、理气安胎、温脾止泻之功效,其主要来源于阳春砂Awomum villosum Lour.的干燥成熟的果实,砂仁的主要的药效成分为萜类化合物,如乙酸龙脑酯、樟脑、龙脑等。萜类合酶(terpene synthase,TPS)是萜类下游生物合成途径的关键酶。前期研究已经从阳春砂转录组中筛选出了 10个TPS基因,并鉴定了其中的蒎烯合酶和龙脑基二磷酸合酶(BPPS,bomyl diphosphate synthase)。由于阳春砂含有的萜类成分十分丰富,尤其在药用部位果实中富含单萜和倍半萜,负责这些单萜和倍半萜合成的TPS还有待挖掘。因此,本研究从近期获得的果实为主的转录组数据中挖掘更多的TPS基因,并对其进行克隆和功能鉴定,以期更全面地认识阳春砂果实中的挥发性萜类的生物合成及其TPS家族,同时也为挥发性萜类的代谢工程提供更丰富的候选基因。另一方面,课题组前期已获得的阳春砂药效萜类合成途径中最关键的TPS——龙脑基二磷酸合酶(bomyl diphosphate synthase,AvBPPS),其特殊性不仅在于其产物多样,且其主产物龙脑基二磷酸(BPP)是阳春砂主要药效萜类物质乙酸龙脑酯、樟脑、龙脑的直接或间接前体。海南砂Amomum longiligular T.L.Wu是阳春砂的近源物种,也是砂仁的来源植物,本研究克隆海南砂的BPPS,同时合成文献已报道的LdBPPS(来源于甜舌草Lippia dulcis),将AvBPPS与这两个BPPS进行功能比较和氨基酸序列比对,以期发现关键氨基酸位点,为优化AvBPPS的功能提供基础。2.方法2.1阳春砂果实转录组测序及挥发性萜类2.1.1转录组数据分析及AvTPS挖掘以阳春砂两个成熟期(45 DAF和75 DAF)果实的果皮、种子团和根状茎为材料(每个组织部位设置3个生物学重复),进行转录组测序,对测序质量、注释信息进行分析。以已知的AvTPS1-10候选基因的序列进行本地blast,再结合Pfam蛋白结构域预测结果,筛选出预测为TPS的全部unigene,然后滤去序列小于500bp的unigene,且合并可能为同一TPS的unigene,最终获得候选的AvTPS。根据转录组测序的RPKM值初步分析候选AvTPS的组织表达模式和与挥发性萜类含量的相关性。2.1.2阳春砂萜类化合物的提取与测定用正己烷超声提取法,提取45 DAF果皮(PYF)、45 DAF种子团(SYF)、75 DAF果皮(PF)、75 DAF种子团(SF)、根状茎(CS)中的挥发性萜类化合物,用GC-MS对上述部位的萜类化合物进行测定,用标准品制作标曲进行定量。2.2候选TPS基因的克隆与功能鉴定2.2.1 TPS基因的克隆及原核表达以目的基因表达量高的组织部位cDNA为模板,克隆候选的TPS基因,构建重组克隆载体,并以重组克隆载体质粒为模板,采用In-fusion方法构建带有双His标签的pET 32a重组原核表达载体,利用Rosetta(DE3)表达菌株进行原核表达。2.2.2 TPS蛋白纯化及功能鉴定利用IPTG诱导融合TPS蛋白表达,用Ni-NTA柱纯化融合蛋白,并以GPP或FPP为底物进行体外酶促反应,通过GC-MS检测TPS催化产物。2.2.3基因表达模式分析以阳春砂75 DAF种子团(SF)、75 DAF果皮(PF)、花(F)、叶(L)、根状茎(CS)为材料,提取RNA并反转录为cDNA,利用实时荧光定量的方法检测TPS在阳春砂各组织部位的表达量,与不同组织部位中检测到的挥发性萜类化合物的含量进行相关性分析。2.2.4 TPS gDNA及启动子的克隆以阳春砂叶片基因组DNA(gDNA)为模板,克隆TPS的gDNA序列,根据目的基因的gDNA序列设计三条特异性引物,用FPNI-PCR的方法从阳春砂gDNA中克隆目的基因的启动子,并分析启动子的转录起始位点以及顺式表达元件。2.3 BPPS的功能比较2.3.1海南砂BPPS的克隆和表达载体构建从海南砂未成熟的种子团转录组数据中筛选候选的TPS基因,进行序列比对和系统进化树分析,选取与阳春砂AvBPPS相似性最高的序列设计引物,采用巢式PCR的方法扩增其编码区,采用In-fusion的方法将AvBPPS-T47和AlBPPS的片段构建到pET-32a表达载体中。2.3.2甜舌草LdBPPS的合成从GenBank下载甜舌草LdBPPS的核苷酸序列(MF133333.1),委托公司合成其原核表达的编码区,并构建到pET32a表达载体中。2.3.3不同BPPS的催化产物比较原核表达和蛋白纯化的方法同2.2.1和2.2.2,为了检测到产物龙脑,底物反应后加入碱性磷酸酶,对产物进行脱磷酸处理,进行GC-MS检测。2.3.4阳春砂和海南砂BPPS在果皮和种子团中的表达模式分别以阳春砂45 DAF果皮(AvP)、阳春砂45 DAF种子团(AvS)、海南砂45 DAF果皮(AlP)、海南砂45 DAF种子团(AlS)为材料,用实时荧光定量的方法检测基因相对表达量,将基因表达量与相应萜类产物含量进行相关性分析。3.结果1.阳春砂果实转录组、AvTPS筛选及挥发性萜类分析果实转录组的组装质量较好,所获得的unigene序列普遍较长,在Nr数据库中注释率高达99.48%;KEGG代谢通路中,次生代谢生物合成途径中注释到unigene最多;萜类骨架合成途径中,MEP途径注释到的unigene多于MVA途径。筛选出了22个候选的AvTPS,包括6个单萜合酶、9个倍半萜合酶和7个二萜合酶基因,热图分析表明各基因在不同组织中的表达量有差异。萜类化合物的检测结果表明阳春砂中含有丰富的挥发性萜类化合物,总共检测到了 45种萜类化合物,其中包括单萜17种、倍半萜27种和1种二萜类成分,乙酸龙脑酯、樟脑、龙脑等都在阳春砂种子团中被检测到,SF中的挥发性萜类总含量高于SYF,PF中的挥发性萜类总量也高于PYF,表明果实从45 DAF到75 DAF过程中,挥发性萜类物质仍处于积累的过程中。种子团中单萜化合物的种类比果皮和根状茎中的丰富,萜类含量也高于果皮和根状茎,但果皮和根状茎中检测到了一种二萜化合物,是种子团中未检测到的。22个AvTPS在5个组织部位的RPKM值与45种挥发性萜类含量的相关性分析显示:被预测为单萜合酶的TPS与部分单萜化合物具有较高的相关性,被预测为倍半萜合酶的TPS不仅与单萜化合物相关性高,且与倍半萜化合物也具有较高的相关性,部分二萜合酶与二萜化合物相关性较高。2候选TPS基因的克隆与功能鉴定系统发育进化树将22个AvTPS聚类到7个不同的亚家族中,其中单萜合酶聚类到TPS-b亚家族,倍半萜合酶主要聚类到TPS-a亚家族,二萜合酶主要聚类到TPS-c和d亚家族。成功克隆了其中9个AvTPS,包括1个单萜合酶基因AvTPS2,5个倍半萜合酶基因-AvTPS6、AvTPS15、AvTPS16、AvTPS17、AvTPS18和3个二萜合酶基因-AvTPS5、AvTPS9、AvTPS19,构建了原核表达载体,并进行了蛋白纯化。AvTPS2、AvTPS5、AvTPS6、AvTPS15、AvTPS18五个基因的蛋白表达效果较好;AvTPS17和AvTPS19两个基因诱导的蛋白均为包涵体:AvTPS9和AvTPS16两个基因并未诱导出目的蛋白。AvTPS2与GPP反应的主产物为linalool,副产物为β-myrcene、limonene、trans-β-ocimene、β-cis-ocimene、carene,可将 AvTPS2 命名为芳樟醇合酶;AvTPS2 在PF和花中表达量较高,在SF和CS中几乎不表达,在PF和花中检测到其主产物linalool,在SF和CS中均未检测到该化合物。AvTPS6与GPP反应的主产物为(2E)-1-Methoxy-3,7-dimethylocta-2,6-diene,副产物为β-myrcene、limonene、α-terpinene、α-terpineol、cis-geraniol;与 FPP 反应的主产物为 humulene,副产物为 caryophyllene,可将AvTPS6命名为凬草烯合酶;AvTPS6在SF中的表达量高于PF,且在SF检测到humulene的含量高于PF,与表达模式一致。AvTPS15与GPP反应的产物为β-myrcene、limonene、cis-β-terpineol、β-terpinene、linalool、linalool methyl ether、α-terpineol、(2E)-l-Methoxy-3,7-dimethylocta-2,6-diene、Geraniol;与 FPP 反应的主产物为α-santalene和α-bergamotene,副产物为(Z)-γ-bisabolene、β-sesquiphellandrene,可将其命名为檀香烯/α-香柑油烯合酶,AvTPS15在SF中高表达,而其催化的主产物α-santalene和cis-α-bergamotene,正是在SF中检测到的;AvTPS18与GPP反应的主产物为(2E)-l-Methoxy-3,7-dimethylocta-2,6-diene,与 FPP 反应产物为β-elemene,将其命名为榄香烯合酶,AvTPS18在PF和CS中表达量较高,在SF中也有表达,而其催化产物β-elemene仅在SF中检测到。另外,克隆了AvTPS2和AvTPS6包含完整编码区的基因组序列,它们都含有7个外显子和6个内含子,基因组结构与已报道的单萜或倍半萜合酶基因相似。进一步克隆获得了AvTPS6的启动子片段,分析发现其具有TATA-box和G-box等顺式调控元件。2.龙脑基二磷酸合酶BPPS的功能比较从海南砂转录组中筛选到与AvBPPS最相似的基因AlBPPS,从种子团cDNA克隆获得其1791bp的编码区序列。系统发育进化树表明,其与AvBPPS聚为一支,均属于TPS-b亚家族;多序列比对结果表明AlBPPS与其它物种的BPPS序列一致性为60.06%,与AvBPPS的序列一致性为82.55%,两者的保守结构域序列几乎一致,仅在“DTE”中有一个氨基酸差异位点,AlBPPS(A496)为丙氨酸(A),AvBPPS(G495)则为甘氨酸(G)。AlBPPS的转运肽为47aa,其他BPPS在原核表达时截去的N端长度都比AvBPPS截去的更长,因此,本研究也对截去更长N端的AvBPPS-T47(N端截去 47 个氨基酸)进行了研究。比较 AvBPPS-T26、AvBPPS-T47、AlBPPS、LdBPPS与GPP反应并脱磷酸后的产物,4个BPPS均产生了龙脑,AvBPPS-T26的催化产物中龙脑的产量占产物总量57.55%,camphene、limonene、β-mycrene分别占21%、19%、6%;AvBPPS-T47的催化产物中borneol、camphene、limonene占产物总量的百分比均有所下降,同时产生了新的化合物α-pinene,但龙脑的产量相比于AvBPPS-T26有所提高;AlBPPS的催化产物中camphene作为主产物,占总产量的59.92%,bomeol和limonene则分别占21.16%和6.21%,其他副产物的总和占12.70%;LdBPPS的反应产物经过脱磷酸后产生6种化合物,其中camphene占总产量的45.31%,borneol、limonene、α-pinene、terpinolene、β-mycrene 分别占总产量的 24.72%、11.36%、8.47%、6.06%、4.08%。AvBPPS-T26催化产物中龙脑的比率最高,LdBPPS催化产物种类最丰富。半定量的结果表明AvBPPS、AlBPPS在主要在种子团中表达,实时荧光定量表明阳春砂45 DAF种子团(AvZ)中的表达量远高于海南砂45 DAF种子团(AlZ),且在海南砂45 DAF果皮(AlP)中低表达,在阳春砂45 DAF果皮(AvP)中不表达,与对应组织部位中检测到的直接或间接催化产物的含量总和的趋势基本一致。4.结论本文从阳春砂以果实为主的转录组中筛选到了 22个候选的AvTPS,克隆并鉴定了其中1个单萜合酶(AvTPS2)和3个倍半萜合酶(AvTPS6、AvTPS15、AvTPS18)基因,根据其主产物分别命名为芳樟醇合酶、凬草烯合酶、檀香烯/α-香柑油烯合酶和榄香烯合酶,其在不同组织部位的表达模式与萜类产物含量基本一致,它们均为多产物的TPS,其中AvTPS6、AvTPS15、AvTPS18是双功能合酶,既能催化GPP,也能催化FPP生成多样的萜类产物。本文的研究结果丰富了对阳春砂挥发性萜类合成机制的认识。对AvBPPS-T26、AvBPPS-T47、AlBPPS、LdBPPS脱磷酸产物中龙脑比率的比较,为后续优化AvBPPS的功能提供了基础。
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广州中医药大学２０１９届硕士学位论文ｅ邋ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＦＰＰＳ）、栊牛儿邋樵牛儿基焦磷ｎｙｌ邋ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ邋ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＧＧＰＰＳ）的作用下经头尾缩合生们分别是单萜、倍半萜、二萜化合物的前体物质＾￣１８］。在ＴＰ的单萜，倍半萜和二萜，最后通过修饰酶作用下形成结构和这一阶段决定了萜类化合物结构的多样性。逡逑

广州中医药大学２０１９届硕士学位论文逦逡逑、呕吐泄泻、妊娠恶阻、胎动不安等症，中药饮片的煎制方法为后下，以便更好逡逑挥其药效作用。阳春砂的果实中富含挥发油，油中主要含有乙酸龙脑酯（ｂｏｍｙｌ逡逑ｔａｔｅ）、樟脑（ｃａｍｐｈｏｒ）、龙脑（ｂｏｒｎｅｏｌ）等成分，，主要为x2类化合物，其中乙酸逡逑酯作为砂仁的质量评价指标Ｍ。另外，阳春砂中也包含其他单萜和倍半萜等多种逡逑性萜类化合物。逡逑龙脑基二磷酸合酶ＢＰＰＳ的研宄进展逡逑龙脑基二a愃岷厦福ǎ猓铮恚�ｌ邋ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ邋ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＢＰＰＳ）是存在于植物体内的一逡逑殊的ＴＰＳ，在植物次级代谢产物的合成途径中，ＢＰＰＳ能够催化底物ＧＰＰ生成龙逡逑二磷酸，进一步通过磷酸酶的催化作用生成龙脑，龙脑则分别在乙酰转移酶和酶的作用下生成乙酸龙脑酯和樟脑，如图２，因此龙脑基二磷酸是龙脑、樟脑和乙逡逑脑酯的直接或间接前体叫，因此，ＢＰＰＳ则认为是合成阳春砂主要挥发性萜类化逡逑的关键酶。逡�

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