糖痹康对糖尿病小鼠周围神经PTEN介导DNA氧化损伤的作用与机制研究

发布时间：2020-05-10 19:02

【摘要】：[目的]从整体、细胞和分子水平,研究中药复方糖痹康颗粒对糖尿病小鼠坐骨神经PTEN介导的氧化损伤的保护作用,以及糖痹康含药血清干预高糖诱导雪旺细胞氧化损伤及细胞凋亡的作用机制。[方法]1.整体实验采用SPF级ICR品系雄性小鼠,给予一次性腹腔内注射STZ诱导造模。正常对照组注射等量的柠檬酸盐缓冲液。STZ注射72h后测量小鼠尾尖血糖值,将两次随机血糖不低于300 mg/dL(≥16.7 mmol/L)的小鼠按血糖和体重随机数字表法进行分组,分别记为模型组,中药高、中、低组,及西药组,每组10只。连续给药干预16周。实验过程中记录小鼠一般状况,检测治疗前及治疗后4w、8w、12w、16w体重和血糖变化。治疗后16w时进行热痛觉阈值测定,于麻醉状态下行坐骨神经传导速度、神经血流量测定,取血清检测ROS、T-AOC水平。取坐骨神经组织,4%多聚甲醛固定制作石蜡切片,常规HE染色、进行病理形态学观察;ELISA法测定坐骨神经组织匀浆中8-OHdG的表达水平;免疫组化法坐骨神经石蜡切片中cleaved-PARP和PTEN的蛋白表达;实时荧光定量PCR法检测PTEN和caspase3 mRNA表达。2.细胞实验体外培养大鼠雪旺细胞。SD大鼠灌胃3天制备糖痹康含药血清及硫辛酸含药血清。永生型大鼠来源雪旺细胞株RSC96常规复苏、培养、传代至3-5代,采用CCK-8法检测24h、48h时间点糖痹康含药血清对细胞活力的影响,采用流式细胞仪检测FITC-AnnexinV/PI双标记的细胞凋亡水平,倒置荧光显微镜检测荧光探针DCFH.DA标记的ROS表达,ELISA法检测细胞上清液中8-OHdG分泌水平,Western blot检测Nrf2在细胞核/细胞质的表达及转移率,及PTEN、p-AKT、AKT、cleaved-caspase3、cleaved-PARP、抗氧化酶NQO1和HO-1蛋白表达;实时荧光定量PCR检测PTEN、caspase3、NQO1、HO-1 的 mRNA 表达。[结果]1.整体实验药物干预16周,模型组小鼠出现多饮、多尿、消瘦,体重降低伴血糖明显升高(p0.05或p0.01);同时间点比较,中药高、中、低剂量组和西药组血糖水平明显降低(p0.05或p0.01),体重增长明显升高(p0.05或p0.01)。行为学结果表明,造模16周,模型组小鼠出现严重的热痛觉减退,足底和尾部热痛阈值显著增高(p0.01),中药各剂量组和西药组小鼠痛阈值减低(p0.05或p0.01),以中药中剂量组改善作用最为显著。神经电生理检测及微循环灌注量检测结果表明,与正常组比较,模型组小鼠MNCV、SNCV显著减慢,CMAp、SNAP和Flux减低(p0.05或p0.01),中药高、中、低剂量及西药ALA干预均可以明显提高SNCV、SNAP及Flux(p0.05或p0.01),中药高剂量组还能有效感受MNCV和CMAP(p0.01)。形态学观察结果,模型组小鼠坐骨神经纤维排列松散、结构紊乱甚至断裂,中药各组和西药组均可见不同程度的减轻。血清检测结果表明,与正常组相比,模型组ROS水平明显升高,T-AOC降低;与模型组比较,中药各剂量组和西药组ROS减低,T-AOC增高(p0.05或p0.01),其中中药高剂量组作用优于中、低剂量组。坐骨神经组织中8-OHdG含量结果表明,与正常组比较,模型组及各治疗组8-OHdG表达均显著升高(p0.05或p0.01);与模型组比较,中药高、中剂量组能够有效降低8-OHdG水平,作用优于西药组(p0.05)。免疫组化法检测结果显示,与正常组相比,模型组PTEN和cleaved-PARP的蛋白表达明显增高(p0.01);与模型组比较,中药高、中剂量组和西药组PTEN和cleaved-PARP表达降低(p0.05或p0.01),中药高剂量组作用优于中、低剂量机组和西药组。PCR检测结果显示,与正常组相比,模型组PTEN及caspase3 mRNA表达显著升高(p0.01),NQO1、HO-1表达无明显升高(p0.05);与模型组比较,中药高、中剂量组与西药组PTEN及 caspase3 mRNA 表达明显降低(p0.05 或p0.01)。2.细胞实验细胞活力检测结果表明,与CON组相比,50mM高糖(HG)组细胞活力显著降低(p0.01),总凋亡水平均显著增高(p0.01),ROS及8-OHdG表达显著增高(p0.01);与HG组相比,TBK组和ALA组细胞活力增高(p0.05或p0.01),凋亡水平降低(p0.05或p0.01),其中TBK组早期凋亡率显著降低(p0.01),ROS和8-OHdG表达降低(p0.05或p0.01)。Western blot结果显示,与CON组比,,HG组组PTEN、cleved-caspase 3、cleaved-PARP蛋白表达上调,AKT磷酸化降低(p0.05或p0.01);与HG组比较,TBK组PTEN、cleaved-caspase 3、cleaved-PARP蛋白表达水平降低,同时Nrf2核转移升高,p-AKT、NQO1、HO-1表达增加。PCR结果表明,与CON组相比,HG组PTEN和caspase3mRNA表达增强,NQO1、HO-1mRNA表达无差异(p0.05)。糖痹康和ALA 能够下调 PTEN、caspase 3mRNA 表达,上调 NQO1、HO-1mRNA 表达(p0.05或p0.01)。[结论](1)中药复方糖痹康能够缓解DPN小鼠血糖升高和体重减轻,降低热痛阈值,提高神经传导速度,改善神经微循环血流量,减轻神经纤维结构紊乱。其保护机制可能与调节神经组织氧化应激状态,减轻DNA损伤和细胞凋亡有关。(2)糖痹康含药血清能够减轻高糖抑制的细胞增殖,减少DNA损伤和细胞凋亡。这可能是通过调节PTEN表达,上调AKT-Nrf2途径增强细胞抗氧化酶水平,与下调PARP修复损伤实现的。
【图文】：

阈值,小鼠,足底,痛觉迟钝

图１－２药物干预前后各组小鼠血糖结果逡逑３．４热痛觉阈值测定结果逡逑如表１－３、图１－３所示，与正常组比较，，模型组ＰＷＴＬ显著升高（Ｐ＜０．０１），提示逡逑糖尿病小鼠足底温度觉和痛觉敏感度降低。与模型组比较，缩足反应时间均减少，其中逡逑西药组和中药低剂量、中剂量组ＰＷＴＬ明显降低（Ｐ＜０．０１或Ｐ＜０．０５）。提示药物干预逡逑１６周能够明显改善小鼠足底热痛的敏感性。逡逑光刺激甩尾实验测定结果显示，与正常组比较，模型组出现甩尾反应明显时间延长，逡逑ＴＦＬ升高（Ｐ＜０．０１），提示模型组小鼠发生尾部组织的痛觉迟钝。与模型组相比，各治逡逑疗组均能有效缩短反应时间，ＴＦＬ数值减小（Ｐ＜０．０１或Ｐ＜０．０５）。提示药物干预可以逡逑降低ＳＴＺ诱导ＤＰＮ小鼠的热痛阈值增高，改善热痛感觉迟钝。逡逑４９逡逑

小鼠,检测结果,糖尿病小鼠,运动神经传导速度

３．５神经电生理检测结果逡逑给药１６周，各组小鼠在麻醉状态下进行神经电生理检测。由表１－４－１、表１－４－２和逡逑图＾４－１、图１－４－２可见，与正常组相比，模型组出现感觉神经及运动神经传导速度降低、逡逑感觉电位和动作电位振幅减小（Ｐ＜0．0ｌ或Ｐ＜0．0５），提示ＳＴＺ造模１６周糖尿病小鼠感逡逑５０逡逑
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5

【参考文献】