糖耐康对糖脂毒性诱导的胰岛细胞株INS-1损伤的保护作用研究

发布时间：2020-05-14 07:57

【摘要】：[目的]本实验通过体外培养胰岛β细胞INS-1糖脂毒模型,用“益气养阴清热”糖耐康进行分组干预,观察糖耐康对糖脂毒下的胰岛β细胞活力、凋亡以及胰岛素分泌的影响,并进一步从胰岛β细胞胰岛素信号转导通路探讨糖耐康对PI3K/Akt下游FOXO1等因子的影响,探索其具体作用靶点。为中药治疗糖脂毒诱导的早期2型糖尿病提供理论依据。[方法]1.糖耐康含药血清对糖脂毒损伤的INS-1细胞活力的影响体外选用大鼠胰岛素瘤细胞系INS-1细胞为本实验研究对象,以33.3mM葡萄糖刺激培养INS-1细胞构建糖毒性模型,以0.5mM棕榈酸刺激培养INS-1细胞构建脂毒性模型,33.3mM葡萄糖联合0.5 mM棕榈酸刺激培养INS-1细胞构建糖脂毒性模型。制备糖耐康含药血清,分糖耐康低(5%)、中(8%)、高(10%)剂量进行干预,以盐酸二甲双胍作为西药对照,以高糖、棕榈酸、高糖联合棕榈酸分别作为模型对照。CCK-8检测各组INS-1细胞活力、流式细胞荧光染色以及caspase-3活性观察细胞凋亡、ELISA测葡萄糖刺激下INS-1细胞的胰岛素分泌功能。2.糖耐康含药血清对糖脂毒损伤的INS-1细胞胰岛素信号转导通路的影响糖脂毒造模方法同上。制备糖耐康含药血清,分糖耐康低(5%)、中(8%)、高(10%)剂量进行干预,以盐酸二甲双胍作为西药对照,以高糖、棕榈酸、高糖联合棕榈酸分别作为模型对照。采用免疫印迹法测定胰岛素信号转导通路中胰岛素受体底物-2(IRS2)及PI3K下游相关蛋白:叉头转录因子(FOXO1),蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)的蛋白质含量,以及IRS2(ser731)、FOX01(ser256)、P70s6k(htr389)的磷酸化水平。[结果]1.糖耐康含药血清对糖脂毒损伤的INS-1细胞活力的影响高糖、高脂、高糖联合高脂均能够显著降低INS-1细胞活力。经中药糖耐康干预后,与模型组相比,高剂量糖耐康组的细胞活力明显上升、caspase-3活性明显被抑制、胰岛素分泌功能BIS、GSIS数值明显上升。低剂量及中剂量糖耐康对上述指标均有不同程度改善。与二甲双胍对照组相比,高剂量糖耐康与二甲双胍无统计学意义。2.糖耐康含药血清对糖脂毒损伤的INS-1细胞胰岛素信号转到通路的影响高糖、高脂、高糖联合高脂组IRS2蛋白表达降低,磷酸化水平升高。FOX01(ser256)、P70s6k(htr389)的磷酸化水平降低,PTP1B蛋白表达升高。经中药糖耐康干预后,与模型组相比,高剂量糖耐康组的细胞IRS2蛋白表达升高,磷酸化水平降低。FOXO1(ser256)、P70s6k(htr389)的磷酸化水平升高,PTP1B蛋白表达降低。与二甲双胍对照组相比,高剂量糖耐康与二甲双胍无统计学意义。[结论]1.糖耐康能够改善糖脂毒刺激下的INS-1的细胞活力,抑制凋亡,改善胰岛素分泌功能。2.糖耐康能够调控糖脂毒刺激下的INS-1的细胞胰岛素信号转导通路中的IRS2、PTP1B、FOX01因子,升高P70s6k(htr389)磷酸化水平,改善胰岛细胞功能,进而调节糖脂代谢。
【图文】：

增强错误蛋白的降解等，如果此种不良刺激不停止，内质网应激持续存在，细胞开逡逑始凋亡。活化转录因子６（ＡＴＦ邋－６）、蛋白激酶Ｋ样内质网激酶（ＰＥＲＫ）、肌醇依赖酶－１邋（ＩＲＩＭ）逡逑是内质网上的跨膜蛋白，构成了内质网应激的三条通路。如图１：逡逑

细胞活力下降至５１．邋９０％士４．８９％邋（ｐ＜０．邋００１），７２ｈ时，细胞活力下降至３９．邋７２％逡逑±４．邋０９％邋（ｐ＜０．邋００１）。３３．邋３ｍｍｏｌ／Ｌ的高糖培养液减弱了邋ＩＮＳ－１细胞活力，且和刺激时间逡逑呈正相关（见图１－１）。临床上早期糖尿病患者会有高胰岛素血症现象，短期高血糖刺激，逡逑胰岛细胞会增加胰岛素的产生，长时间刺激胰岛素分泌则会持续下降。本实验的几个时逡逑间节点未发现胰岛细胞活力增加的表现，原因可能有二：一是应选取更短的时间节点观逡逑察，如４ｈ或者６ｈ；二是临床高胰岛素血症并不能说明胰岛细胞活力增强。逡逑１２０．００％逡逑１００．００％邋＾逡逑ｒｅ邋６０．００％邋－逡逑ｕ邋４０．００％邋－逦＾逡逑２０．００％邋－逡逑０．００％邋＼逦！逦１逦，逦，逡逑Ｏｈ逦１２ｈ逦２４ｈ逦４８ｈ逦７２ｈ逡逑图１－１高糖对ＩＮＳ－１细胞活力的影响（林＊邋ｐ＜０．邋００１）逡逑２．邋１．邋１．邋２高脂对ＩＮＳ－１细胞活力的影响逡逑经过０．５ｍｍｏｌ／Ｌ棕榈酸不同时间的培养后，，与正常组相比，ＩＮＳ－１细胞１２ｈT，其逡逑活力下降至邋８１．４５％士５．５２％邋（ｐ＜０．００１），邋２４ｈ邋时，其活力下降至邋７０．邋０６％±３．１０％邋（ｐ＜逡逑０．００１）
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5

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本文编号：2663058