金雀异黄素调控miR-21对LPS活化的小鼠巨噬细胞凋亡的影响

发布时间：2020-05-16 06:12

【摘要】：目的:研究金雀异黄素(genistein,GEN)对脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)活化的小鼠巨噬细胞凋亡的影响,以及是否与调控mi R-21有关。方法:1.应用不同浓度LPS(0、500、1 000 ng·m L-1)活化RAW264.7细胞12h或24h,q RT-PCR检测TNF-α和IL-6 m RNA表达,Western Blot检测COX-2和i NOS蛋白表达。使用不同浓度GEN(10、20、40μM)预孵育细胞2h,再与LPS(1 000 ng·m L-1)共同孵育24h后,CCK8检测细胞活力,Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡,q RT-PCR检测caspase-3、caspase-8、Bcl-2、Bax、CHOP基因表达,Western Blot检测caspase-3、caspase-8、Bcl-2、Bax、CHOP凋亡蛋白表达。GEN(20μM)预处理细胞2h,再与LPS(1 000 ng·m L-1)共孵育24h后,q RT-PCR检测mi R-21基因表达。2.分别使用携带mi R-21 NC、mi R-21 OE、mi R-21 NC、mi R-21 KD的慢病毒感染RAW264.7细胞,经嘌呤霉素筛选,构建稳定细胞系,LPS处理24h,CCK8检测细胞活力,q RT-PCR检测caspase-3、caspase-8、Bcl-2、Bax、CHOP和mi R-21基因表达,Western Blot检测caspase-3、caspase-8、Bcl-2、Bax、CHOP蛋白表达。3.GEN预处理慢病毒介导的mi R-21 NC、mi R-21 OE、mi R-21 NC、mi R-21 KD细胞2h,再与LPS共孵育24h,CCK8检测细胞活力,q RT-PCR检测caspase-3、caspase-8、Bcl-2、Bax、CHOP基因表达,Western Blot检测caspase-3、caspase-8、Bcl-2、Bax、CHOP蛋白表达。结果:1.与对照组相比,LPS(1 000 ng·m L-1,24h)可以明显上调TNF-α和IL-6 m RNA表达(P0.05),促进COX-2和i NOS蛋白表达。因此,我们选取1 000 ng·m L-1 LPS孵育24h作为活化RAW264.7细胞的最佳药物浓度和作用时间。与对照组相比,LPS可明显增强细胞活力(P0.05),降低细胞凋亡率,下调caspase-3、caspase-8、Bax、CHOP基因(P0.05)及蛋白表达,上调Bcl-2基因(P0.05)及蛋白表达。与LPS组相比,GEN(10、20、40μM)可呈浓度依赖性抑制LPS活化的RAW264.7细胞活力(P0.05),升高细胞凋亡率,并促进caspase-3、caspase-8、Bax、CHOP基因(P0.05)及蛋白表达,抑制Bcl-2基因(P0.05)及蛋白表达。综合考虑,在GEN 20μM具有统计学差异,所以,我们选取20μM为GEN最佳药物浓度。与对照组相比,LPS可明显上调mi R-21表达(P0.05);与LPS组相比,GEN可明显下调mi R-21表达(P0.05)。2.与mi R-21 NC组相比,mi R-21 OE组mi R-21表达上调约2.5倍(P0.05),与mi R-21 NC相比较,mi R-21 KD组中mi R-21表达下调约70%(P0.05),可以用于后续实验。mi R-21 OE增强LPS活化的RAW264.7细胞活力(P0.05),下调caspase-3、caspase-8、Bax、CHOP基因(P0.05)及蛋白表达,上调Bcl-2基因(P0.05)及蛋白表达。mi R-21 KD抑制LPS活化的RAW264.7细胞活力(P0.05),上调caspase-3、caspase-8、Bax、CHOP基因(P0.05)及蛋白表达,下调Bcl-2基因(P0.05)及蛋白表达。3.与RAW264.7+GEN+LPS组相比,mi R-21 OE+GEN+LPS组细胞活力明显增强(P0.05),caspase-3、caspase-8、Bax、CHOP基因(P0.05)及蛋白表达均下降,Bcl-2基因(P0.05)及蛋白表达均升高。与RAW264.7+GEN+LPS组相比,mi R-21 KD+GEN+LPS组细胞活力明显下降(P0.05),caspase-3、caspase-8、Bax、CHOP基因(P0.05)及蛋白表达均升高,Bcl-2基因(P0.05)及蛋白表达均下降。结论:GEN可能通过下调mi R-21表达,促进LPS活化的RAW264.7细胞凋亡。
【图文】：

图 1-1 构建 LPS 活化的 RAW264.7 细胞模型 RAW264.7 细胞经 LPS 处理 12h或者 24h。qRT-PCR 检测 TNF-α（A）、IL-6（B）mRNA 表达，Western Blot 检测 COX-2（C）、iNOS （D）蛋白表达。n=3， x±s，*P<0.05。1.3.2 GEN 对 LPS 活化的 RAW264.7 细胞活力影响分别使用 10、20、40 μM GEN 预处理细胞 2h，再与 LPS（1 000 ng·mL-1）共孵育 24h。与对照组相比，LPS 明显增加细胞活力（P<0.05）；GEN（10、20、40μM ）则呈浓度依赖性抑制 LPS 活化的 RAW264.7 细胞活力，见图 1-2。

LPS 活化的 RAW264.7 细胞活力的影响 不同育细胞 2h，再与 LPS 共同孵育 24h，，CCK8 *P<0.05。 LPS 活化的 RAW264.7 细胞凋亡率的N（10、20、40 μM ）预孵育细胞 2h，再与 LP用 Annexin V-FITC/PI 凋亡试剂盒检测细胞凋率为 5.3%，GEN 组（10、20、40 μM）凋
【学位授予单位】：湖南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5

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本文编号：2666294