葛根素纳米晶自稳定Pickering乳液口服吸收机制的初步探索

发布时间：2020-05-17 21:37

【摘要】：药物纳米晶自稳定Pickering乳液(Nanocrystals self-stabilized Pickering emulsions,NSSPE)是一种新型乳液,此剂型可提高难溶性成分的口服生物利用度。课题组前期以葛根素(Puerarin,Pu)为模型药,以川芎油:油酸聚乙二醇甘油酯(Labrafil M 1944 CS)=9:1(v/v)为油相,成功构建了葛根素NSSPE(Puerarin nanocrystals self-stabilized Pickering emulsion,Pu-NSSPE)。大鼠灌胃给药的药动学试验证实,Pu-NSSPE相对于Pu原料药混悬液、纳米晶混悬液(NCS)、含吐温80的普通乳的生物利用度分别为262.43%、155.92%和223.65%。然而,课题组并未对NSSPE的口服吸收机制进行研究。NSSPE作为一种全新的药物载体,为何可以显著提高难溶性药物的口服生物利用度待进一步探讨。本研究在前期研究基础上,从模拟胃肠液中状态变化和药物释放,肠吸收动力学和细胞吸收与跨膜转运3个方面对Pu-NSSPE口服后的体内变化和吸收机制进行研究,通过与Pu原料药混悬液、纳米晶混悬液和含吐温80的普通乳比较,揭示NSSPE促进难溶性药物Pu口服吸收的机制。具体研究方法和结果如下:(1)Pu原料药混悬液、纳米晶混悬液、含吐温80的普通乳和NSSPE 4种供试制剂的制备与性质考察制备4种供试制剂:(1)原料药混悬液:Pu加入到含0.3%CMC-Na的pH为11.5的纯水中,水浴超声分散;(2)NCS:Pu加入到pH为11.5的纯水中,高剪切后高压均质;(3)含吐温80的普通乳:Pu与川芎油,Labrafil M 1944 CS和吐温80,搅拌溶解后加入pH为11.5的纯化水,高剪切后高压均质;(4)NSSPE:Pu加入到pH为11.5的纯水中,高压均质先制得Pu纳米晶混悬液,再加入川芎油与Labrafil M 1944 CS的混合油相,继续高压均质。从粒径、电位、药物含量、pH、乳滴形态和稳定性等方面对供试制剂进行评价。结果显示,原料药混悬液中葛根素微粒的粒径为91.32?1.73?m,5 min即发生明显的沉降;NCS中葛根素纳米晶的粒径为250.03±15.65 nm,zeta电位为-29.10?4.12 mV,1 d内稳定;含吐温80的普通乳与NSSPE的乳滴粒径分别为5.59?0.26?m和13.92?0.94?m,zeta电位分别为-39.9±0.5 mV和-46.0±2.36 mV,室温放置14 d后仍保持稳定。各制剂的最终pH均在6-7的范围内。(2)Pu原料药混悬液、纳米晶混悬液、含吐温80的普通乳和NSSPE在模拟胃肠液中的状态变化和药物释放体外模拟胃肠液环境,以含吐温80的普通乳为对照,研究了NSSPE在模拟胃肠液中的状态变化。以原料药混悬液、纳米晶混悬液、含吐温80的普通乳为对照,比较了各制剂在模拟胃液和模拟肠液中的释药速率。模拟胃肠液的状态变化:乳液与模拟胃液分别以1:5、1:50的比例混合,37℃振荡1 h后调节pH为7.5,并加入胆汁提取物和胰酶,37℃继续振荡。NSSPE与模拟胃液混合后样品变清亮,且时间越长、模拟胃液越多,清亮现象越明显;粒径、荧光显微镜和扫描电镜(SEM)显示,NSSPE与模拟胃液1:50接触1 h后,乳滴表面的Pu绿色荧光圈变弱,说明模拟胃液对NSSPE的乳滴结构可能有一定的破坏。模拟胃液对含吐温80的普通乳的影响较弱:外观上看,仅1:50混合1 h后略变清亮,测得的粒径、乳滴形态均无明显变化。进入肠液后,含吐温80的普通乳和NSSPE呈现相似的变化;模拟肠液孵育2 h后,除观察到球状的乳滴外,两种剂型都观察到大量药物结晶,药物结晶的粒径约为0.5-1μm。模拟胃肠液对含吐温80的普通乳和NSSPE的zeta电位影响相同:进入胃液后,zeta电位均显著增大,1 h后的zeta电位分别从原始乳液的-46.0±2.36 mV和-39.9±0.5 mV,变为1.68±0.479 mV和-3.48±0.12 mV;进入肠液后,zeta电位又都显著降低,2 h后分别为-33.10±0.52 mV和-44.57±2.47 mV。药物释放:4种制剂中,原料药混悬液、NCS、含吐温80的普通乳和NSSPE在模拟胃液中240 min的累计释放率分别为75.62±7.00%、99.30±2.48%、83.61±3.80%、80.97±0.90%,模拟肠液中240 min的累计释放率分别为74.60±1.47%、97.19±2.82%、79.00±1.41%、76.54±3.44%。释药规律均符合一级动力学方程。NSSPE释放慢于纳米晶,证实纳米晶在乳滴界面的吸附作用较强。(3)Pu 4种制剂的肠吸收动力学采用大鼠单向肠灌流模型进行肠吸收动力学研究,高效液相色谱法测定灌流液中的Pu浓度。各制剂中的Pu在37℃的K-R液中3 h内稳定,肠段本身和蠕动泵管道对制剂无物理吸附,证实大鼠单向肠灌流模型可用于Pu-NSSPE的肠吸收动力学研究。Pu-NSSPE的K_a和P_(app)值按十二指肠、空肠、回肠和结肠段的顺序依次递减,其中十二指肠显著高于空肠和回肠(P0.05),极显著高于结肠(P0.01),空肠和回肠间没有显著性差异。与其余3种制剂比较,NSSPE在各肠段的吸收均显著高于原料药混悬液和含吐温80的普通乳:十二指肠、空肠、回肠和结肠的P_(app)较原料药混悬液分别提高了2.22、2.05、0.70、1.73倍,较含吐温80的普通乳分别提高了2.77、0.38、0.57、0.70倍。与NCS比较,NSSPE在十二指肠、空肠、回肠和结肠段的P_(app)提高了2.14、0.74、0.34、0.43倍。4种制剂在整个小肠中的吸收顺序为:NSSPENCS含吐温80的普通乳原料药混悬液。(4)体外细胞模型的吸收与转运分别以MDCK细胞和Caco-2细胞模型,以Pu水溶液、含吐温80的普通乳为对照,进行了Pu-NSSPE的细胞摄取实验和双向转运实验,探讨细胞摄取与跨膜转运机制。MDCK细胞试验:比较了不同浓度下Pu 3种制剂的细胞摄取率。结果显示,在100-200μg·mL~(-1)浓度内,MDCK细胞对NSSPE的摄取率显著高于溶液和含吐温80的普通乳(P0.05)。100μg·mL~(-1)下的双向转运实验显示,NSSPE跨MDCK细胞的P_(app)也均显著高于溶液组和含吐温80的普通乳组(P0.05)。这表明,NSSPE较溶液和含吐温80的普通乳更能促进MDCK细胞对Pu的吸收。不同浓度的NSSPE的摄取与转运实验显示,NSSPE在100、150和200μg·mL~(-1)下的细胞摄取率较50μg·mL~(-1)分别提高了68.89%、101.04%和113.16%;但各浓度下的P_(app)之间无显著差异,R_e在1.04-1.24之间。这说明,NSSPE跨MDCK细胞的转运以被动转运为主。Caco-2细胞试验:测定了Caco-2细胞对不同浓度的Pu-NSSPE、Pu水溶液和含吐温80的Pu普通乳的细胞摄取率,同时用激光共聚焦显微镜(CLSM)观察了100μg·mL~(-1)浓度下Caco-2细胞对尼罗蓝标记Pu后制备的3种制剂的摄取。结果显示,50、100、150、200μg·mL~-11 4个浓度下Caco-2细胞对NSSPE的摄取率均显著高于水溶液和含吐温80的普通乳(P0.05);CLSM试验中,在细胞内观察到NSSPE较Pu水溶液、含吐温80的普通乳具有更多的摄入量。加入不同抑制剂的细胞摄取实验显示,染料木素、吲哚美辛(小窝蛋白抑制剂)可显著抑制Caco-2细胞对NSSPE的摄取,细胞摄取率分别较无抑制剂的对照组减少了25.46%和20.17%;联合使用后细胞摄取率进一步减少了33.46%;氯丙嗪(网格蛋白抑制剂)、阿米利洛(巨胞饮功能的抑制剂)与对照组相比无显著差异。100μg·mL~(-1)下的双向转运实验显示,NSSPE组的P_(app)仅显著高于水溶液组(P0.05),与含吐温80的普通乳之间无显著差异。不同浓度NSSPE的双向转运实验显示,随着浓度从50μg·mL~(-1)增大到200μg·mL~(-1),NSSPE跨Caco-2细胞单层转运的通透速率逐渐增大,2 h时200μg·mL~(-1)组的AP→BL累积通透量较100、50μg·mL~(-1)组分别提高了1.99倍和3.90倍。NSSPE在100μg·mL~(-1)浓度下AP→BL和BL→AP方向的P_(app)分别为50μg·mL~(-1)组的1.26和1.57倍,但继续增大浓度至200μg·mL~(-1),2个方向的P_(app)均未显著增大(P0.05)。3个浓度下的R_e均大于1.5。以上结果表明,NSSPE跨Caco-2细胞单层膜转运同时存在被动转运和主动转运。细胞摄取过程存在小窝蛋白介导的内吞,网格蛋白介导的内吞和巨胞饮这两种吸收方式作用很小。以上研究结果再次表明,NSSPE较原料药混悬液、NCS和含吐温80的普通乳能更好的促进Pu的口服吸收,尤其是NSSPE在十二指肠的吸收,这可能与十二指肠较强的酸性环境有关;NSSPE促进Pu口服吸收的机制与增强Pu的溶出无关,其跨膜转运同时存在被动和主动2种机制,以及与小窝蛋白介导的内吞作用有关。
【图文】：

曲线,曲线,峰面积,色谱峰面积

matogram of puerarin standard (left), negative sample (middle) and Pu示，Pu 对照品的保留时间为 7.08 min，供试品溶液在 7，阴性样品对 Pu 的测量无干扰。说明该色谱条件专属性范围度 Pu 对照品溶液的色谱峰面积见表 1-1，标准曲线见图 137.969X + 2.7667，r=0.9999。可见，在 3.125-100 μg·mL峰面积的线性关系良好。表 1-1 Pu 的标准曲线Table 1-1 The standard curve of puerarin浓度/μg·mL-13.125 6.25 12.5 25 峰面积 120.8 235.2 455.5 963 19

形态图,乳滴,吐温80,吐温

图 1-3 光学显微镜观察的 Pu-NSSPE（A）和含吐温 80 的普通乳（B）的乳滴形态Fig. 1-3 Droplet morphology of Pu-NSSPE (A) and surfactant emulsion (B) observed by lightmicroscopy由图 1-3 可以看到 Pu-NSSPE 和含吐温 80 的普通乳均有着较好的乳滴形态，有良好的球形形状，分布较均匀，Pu-NSSPE 的粒径约为 10 m 左右，含吐温 80的普通乳粒径较 NSSPE 小一些，约为 5 m 左右。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R283.6;R285.5

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