九州虫草微生物组学分析及基于系统药理学的生物活性初步研究

发布时间：2020-05-18 12:52

【摘要】：虫草属真菌[Cordyceps(Fr.)Link]是一类有着相似的生活周期和侵染机制的虫生真菌,差异仅在于寄主昆虫和生长条件的不同。九州虫草(Cordyceps kyushuensis Kob)是目前已知的唯一以豆天蛾(Clanis bilineata Walker)幼虫为寄主的虫草,发现于我国的山东蒙山、辽宁沈阳东部山区等,2000年被确认为我国的新记录种,其无性型鉴定为九州轮枝菌(Verticillium kyushuensis)。研究表明,九州虫草中有虫草素、喷司他汀、虫草酸、黄酮类物质、多糖、氨基酸等活性成分。其中,虫草素通过诱导非小细胞肺癌细胞的凋亡、特异性抑制人宫颈癌细胞mRNA转录等发挥相应的抗肿瘤作用,亦可通过作用于成熟树突状细胞诱导调节T细胞增殖而发挥免疫调节作用;合用虫草素与喷司他汀不仅可以有效治疗感染非洲锥虫病的小鼠,美国OncoVista公司更是在FDA批准下共用虫草素和喷司他汀治疗末端脱氧核苷酸阳性白血病细胞(TdT+)等。虽然九州虫草中某些单一活性成分的药理作用已得到证明,但是众多成分所带来的药理活性并不是简单的加和作用,这使其在临床应用时面临着“化学成分多样,作用机制不明确,科学理论未阐明”的瓶颈,不仅是九州虫草,我国传统中药的应用也因此受到限制和约束。随着现代生物技术的发展和进步,出现了以基因组学、转录组学和蛋白质组学等为代表的微生物组学技术和以“整体、多层次网络认知生物体”为核心的系统药理学,它们为传统中药的现代化发展、中药来源的新型药物研发提供了崭新的思路。结合多种组学手段,从分子水平上获取完整的生物体信息,有助于阐明生物体不同发育阶段、疾病/健康状态下的基因和蛋白变化。系统药理学和系统生物学“多重药物对应多重靶点和多种疾病”的思维观念与传统中医药的辩证思维不谋而合。药物与人体内的靶点(基因、蛋白)彼此作用形成了一个庞大和稳健的网络,通过调控其对应的作用靶点、相应的生物进程来治疗疾病。在这种多重组分和多重靶点的协同作用体系下,通过数学计算预测和分子生物学途径来研究药物,结合组学技术提供实用有效的方法快速研究其作用靶点,从分子水平上阐明、验证传统中药的治疗效果,应用药理学的新概念对传统中药的发展做出一定的贡献和推动。本论文研究的对象为九州虫草(Cordyceps kyushuensis Kob),应用转录组学、蛋白质组学技术研究不同发育时期的基因及蛋白表达差异;对九州虫草线粒体全基因组进行测序并分析;在全面总结九州虫草活性成分的前提下,使用系统药理学的技术手段和分析方法对九州虫草潜在的药理活性做出预测,根据预测结果,结合斑马鱼疾病模型对九州虫草水提物的降血糖和降血脂效果进行了验证实验,同时解析高糖/给药状态下自噬表达的改变,从理论和实践两方面对其进行验证。本论文主要研究内容和结论如下:1.首次对九州虫草四个发育时期(菌丝时期CKK1、转色时期CKK2、原基形成初期CKK3和子实体时期CKK4)的转录组和首尾时期(CKK1,CKK4)的蛋白质组进行测序和分析,同时鉴定子实体发育时期的关键酶类。转录组测序结果中,四个发育时期分别转录出了 21351(CKK1),17858(CKK2),17869(CKK3),17088(CKK4)个unigenes。对四个发育时期的基因进行两两比对分析,CKK1-VS-CKK2的878个差异表达基因(DEGs)中有552个上调表达基因(up-DEGs);CKK1-VS-CKK3的811个DEGs中有536 个 up-DEGs;CKK1-VS-CKK4 的 718 个 DEGs 中有 479 个 up-DEGs;CKK2-VS-CKK3 的 1057 个 DEGs 中有 566 个 up-DEGs;CKK2-VS-CKK4 的912个DEGs 中有493 个up-DEGs;CKK3-VS-CKK4 的 907个 DEGs 中有453个up-DEGs。分别对DEGs进行KEGG,GO和KOG注释分析,鉴定了子实体发育时期涉及的关键酶类,42个unigenes参与了子实体发育时期,其中有12个 unigenes 属于 NADH dehydrogenase subunit,2 个 unigenes 属于 NADPH oxidase,2 个unigenes属于 Pheromone receptor,9 个 unigenes属于 G protein subunit,1 个unigene 属于 adenylyl cyclase,2 个 unigenes属于 MAPK通路等,且KEGG结果显示MAPK信号通路是被显著富集的通路之一,表明子实体发育可能更依赖于MAPK信号通路。蛋白质组测序中两个样本时期共鉴定出4185个蛋白质,根据FC1.5或FC0.67的条件筛选出445个差异蛋白,其中224个上调表达蛋白,221个下调表达蛋白,分别对它们进行了 KEGG,GO,KOG功能注释分析。2.在转录组和蛋白质组数据库的基础上,利用Blast对九州虫草活性成分虫草素和喷司他汀的合成基因簇进行了鉴定。喷司他汀作为虫草素的体内“保护者”,可以保护虫草素在体内免被腺苷脱氨酶降解,从而增强其体内药理活性。经鉴定二者在九州虫草中共用同一个合成基因簇,该合成基因簇上包含4个基因,分别命名为ck1-ck4。其中,ck1基因的保守区为氧化还原/脱氢酶区域,ck2基因的保守区为依赖金属的磷酸水解酶HDc家族,ck3基因的保守区域为N末端核苷酸激酶和C末端HisG区域,ck4被blast注释为潜在的ATP结合盒式转运子。3.对九州虫线粒体全基因组进行测序并分析,构建系统发生树分析进化过程。九州虫草的线粒体基因组长度为37520 bp,GC含量为26.55%,含有22个编码基因(3个ATP合成酶F0亚基,1个脱血红素细胞色素β基因,3个细胞色素氧化酶亚基,5个NADH脱氢酶亚基,1个NADH-醌氧化还原酶和9个开放阅读框)和2 1个非编码基因(19个tRNA,1个rrnL和1个rrnS)。系统发生树结果显示,九州虫草与冬虫夏草分离的时间很早,亲缘关系较远;而与蛹虫草有着较近的亲缘关系。该进化结果与近年来对虫草属的重新划分相一致,冬虫夏草被划分为Ophiocordycipitaceae科的Ophiocordycors属,而蛹虫草与九州虫草依旧同属于Cordycipitaceae科的Cordyceps属。4.用大米和豆类培养基培养九州虫草,在7天、20天和30天时分别取样检测虫草素的含量变化,寻找最优化的高产培养基。虫草素含量的增加呈时间依赖型,在五种培养基中,黑豆培养基中虫草素含量最高,其次是黄豆培养基,大米培养基发酵产生的虫草素含量最低。在虫草素发酵中,黑豆和黄豆培养基是最优培养基。同时进行了九州虫草对大米和四种豆类培养基抗氧化活性的作用。结论为九州虫草发酵后的培养基抗氧化活性(ABTS自由基清除率、DPPH自由基清除率、铁离子还原抗氧化力)均有不同程度的增强。5.基于系统药理学的方法预测九州虫草的药理活性。以口服生物利用度"g30%作为筛选九州虫草药理活性成分的标准,共得到42个候选化合物,对应317个人类靶点。根据课题组先前研究积累及后续研究需要,选择五种疾病(非小细胞肺癌、组织淋巴瘤、粒细胞性白血病、高血糖和高血脂)构建“化合物-靶点-疾病网络”和“蛋白质-蛋白质互作网络”。分析网络中的拓扑结构,结果显示:前列腺素G/H合成酶2(PTGS2)、前列腺素G/H合成酶1(PTGS1)、肿瘤坏死因子(TNF)等靶点在非小细胞肺癌、组织淋巴瘤和粒细胞性白血病的治疗中发挥着较为重要的作用,其中PTGS2在良恶肿瘤中均高表达;β1、β2肾上腺素能受体(ADRB1、ADRB2)均为高血糖和高血脂的潜在治疗靶点,且胰岛素抵抗和脂肪细胞因子信号通路同时富集于高血糖和高血脂症,佐证了人体内的糖代谢和脂代谢存在着千丝万缕的内在联系。通过对活性成分、靶点蛋白、疾病之间的潜在关系进行解析,初步解析九州虫草治疗疾病的潜在分子生物学机制。6.在先前预测得到的药理学活性基础上,着重探索九州虫草的降糖、降脂效果,同时探究高糖水平对自噬造成的改变。使用20 g/L的葡萄糖溶液浸泡成年斑马鱼构建斑马鱼高血糖模型和1%蛋黄水饲喂斑马鱼幼鱼构建高血脂模型,随后使用不同浓度的九州虫草水提物对其进行给药处理,检测相关的血糖(血糖值、果糖胺值)、血脂(超氧化物歧化酶活性、丙二醛含量)指标。实验结果表明九州虫草水提物可以显著降低斑马鱼血糖和血脂值,且呈现剂量依赖关系。表型观察研究基础上,对三种状态下的斑马鱼(正常组、10 mg/L给药组和高糖组)进行了转录组测序研究,从基因层面深入分析患病与健康状态下对应基因表达量的改变。正常组与1 0 mg/L给药组,正常组与高糖组的转录组DEGs数量较大,分别有6300、6521个基因表达上调,4632、5768个基因表达下调。10 mg/L给药组与高糖组的DEGs数量较前两组少,分别有941个基因上调和1 673个基因下调,表明高血糖症斑马鱼给药处理后虽然血糖值恢复正常,但体内长期高糖水平对相关基因造成的改变并不能在短时间内恢复。结合实际情况,糖尿病患者在控制血糖稳定后仍会有一系列已发生的并发症难以治愈,这正是糖尿病作为一种综合性代谢疾病的困扰之处,表明了治疗的长期性与困难性。考虑到体内长期的高糖水平可能已经改变了细胞内某些基因和通路的表达,高糖水平下对自噬表达的改变在不同的靶细胞中仍无定论,本次对正常组、给药组和高糖组的糖代谢相关基因(ins,pck1,pdx1,gck,g6pcaa.2)和自噬相关基因(atg3,atg4b,atg5.foxo3)进行了检测分析,结果表明高浓度的糖对斑马鱼体细胞自噬水平呈现抑制作用,给药处理后的斑马鱼细胞自噬能力有所恢复,但仍旧弱于正常组斑马鱼。这为下一步的工作提供了启示:长期给药处理高糖组斑马鱼,在血糖持续稳定的前提下,观察检测其相关基因的表达是否恢复至正常水平,进而探讨糖尿病及其并发症的致病机理和治疗效果。综上所述,本论文应用微生物组学技术从基因和蛋白质层面对九州虫草的完整发育周期进行了全面的解析,随后将传统中药的整体辨析理论对应于微观表现,即“九州虫草多种活性物质作用于多个靶点形成复杂网络”,应用系统药理学预测分析其药理活性,同时结合斑马鱼模型对降血糖、降血脂进行了表观和分子水平的研究。揭示了现代生物技术和分析手段在我国传统中药发展中的新型应用,增加了传统中药应用的理论基础,为老药新用、新药开发以及治疗人类复杂疾病提供了新的思路。
【图文】：

虫草,药理学研究,活性成分

顶端略变尖，干后变褐色，（２０？３０）邋ｍｍｘ邋（５？７．５）邋ｍｍ。子囊壳半逡逑埋生卵形，（３００？５２０）邋ｍｍｘ邋（２００？３００）邋ｍｍ。子囊宽３（ｘｍ？４．５邋ｐｍ柱状。逡逑次生子囊孢子（４．５？７）邋（ｉｍｘ邋（０．６？１）邋ｐｍ柱状（图１－１）。逡逑＇．Ｉ．逡逑图１－１九州虫草（大米培养基上）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１邋Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ邋ｋｙｕｓｈｕｅｎｓｉｓ邋Ｋｏｂ邋ｏｎ邋ｒｉｃｅ邋ｃｕｌｔｕｒｅ邋ｍｅｄｉｕｍ逡逑１．２虫草活性成分及药理学研究逡逑自古以来人们用传统中医理论的“阴阳平衡”来解释虫草的药效，随着医疗逡逑水平的提高，虫草类真菌被证明对现代的许多疾病也有良好的治疗作用，但对逡逑于其活性成分、药理药效及作用机制的研宄却不甚清晰。根据已有的研究，以逡逑下是虫草被报道的有效成分。逡逑１．２．１虫草素、喷司他订及其它核苷类物质逡逑作为一类重要的药用成分，核苷类物质在虫草中至少被检测到８种。虫草逡逑中含有虫草素、腺苷、喷司他汀、鸟苷、尿苷、尿嘧啶，，鸟嘧啶，胸腺嘧啶和逡逑３逡逑

药理学,分析过程,靶点,疾病

一个靶点蛋白产生作用，而是作用于多重疾病通路的多种靶点蛋白［６８，６９］，疾逡逑病与体内的多种基因和蛋白质相互关联作用，这成为新药研发的思路之一，甚逡逑至可以治愈使用西方疗法难以治愈的疾病［７ｅ，７１］（图１－４）。逡逑７逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285;R284

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