基于前列腺膜抗原的肿瘤靶向喜树碱前药设计、合成及活性评价

发布时间：2020-05-22 13:15

【摘要】：研究背景与目的:癌症是严重威胁人类健康和生命的重大疾病之一,其致病因素复杂、发病率和死亡率高。化疗仍是目前临床治疗恶性肿瘤的主要手段之一。常规的化疗药大多存在靶向性差、毒副作用大、生物利用度低和耐药性的缺陷,从而导致临床疗效不佳且患者生存质量差。因此寻找新型靶向抗肿瘤药物具有非常大的临床价值和意义。喜树碱是一种从中药喜树中分离得到的天然抗肿瘤生物碱,其在体内外对胃癌、结直肠癌和膀胱癌等多种恶性肿瘤均表现出较好的抗肿瘤效果,以喜树碱为母体开发了多种临床应用广泛的广谱抗癌药物,但该类药物靶向性差,在临床上常引起呕吐、腹泻、骨髓抑制以及出血性膀胱炎等一系列毒副反应,此外该类药物还存在水溶性差和稳定性差的缺陷。前列腺膜抗原(Prostate specific membrane antigen,PSMA)是位于前列腺上皮细胞表面的Ⅱ型跨膜糖蛋白。研究表明其在前列腺组织和多种非前列腺实体瘤的血管内皮细胞特异性表达,在正常组织中不表达。此外PSMA还具有叶酸水解酶(FOLH)、谷氨酸竣肽酶Ⅱ(GCPⅡ)及N-乙酰基化α-连接的酸性二肽酶(NAALA-Dase)等多种蛋白酶的活性,PSMA是目前肿瘤诊断和肿瘤抗血管治疗的良好靶点和研究热点。本研究在前药原理的指导下,首次以PSMA的特异性水解寡肽底物作为肿瘤靶向配体,设计并合成一系列肿瘤靶向喜树碱前药;利用体外肿瘤细胞模型、重组人PSMA和体内裸鼠移植瘤模型,系统地评价前药的体内外抗肿瘤活性、靶向性和毒性,以期获得高效、低毒、靶向性强、作用机制明确且有临床应用前景的新型喜树碱先导化合物,同时为其它细胞毒类药物的二次开发提供一个新的思路。研究内容:本研究在前药原理指导下,以PSMA的特异性水解底物Asp-Glua*Glu*Glu*Glu(WT-H)、Asp-Glu*Glu*Asp-Glu(HT-H)和Glu*Glu*Glu*Asp-Glu(HT-J)(“*”表示γ-谷酰基连接;“-”表示α-谷酰基连接)作为肿瘤靶向配体,将其与喜树碱20位羟基通过不同的连接片段连接,设计并合成12种全新的水溶性肿瘤靶向喜树碱前药CPT-X;同时为了更好地研究前药的PSMA靶向性,我们合成8种前药CPT-X的PSMA代谢产物CPT-MX;采用PSMA过表达的人前列腺癌LNCaP-FGC(PSMA+)细胞和多种PSMA阴性表达的肿瘤细胞(MCF-7、HepG2、Hela、PC-3和DU145)和人正常肝细胞(L02)评价CPT-X和CPT-MX的细胞毒活性和PSMA靶向性;采用流式细胞分析和激光共聚焦显微镜进一步验证前药CPT-W12的细胞毒选择性和PSMA靶向性;利用重组人PSMA和人乳腺癌细胞MCF-7裸鼠移植瘤模型,采用高效液相色谱法和小动物活体成像系统,评价前药CPT-W12的体外靶向释放和体内靶向分布特性;采用BALB/c小鼠评价前药CPT-W12在小鼠体内的药代动力学特性;采用人乳腺癌细胞MCF-7裸鼠移植瘤模型评价前药CPT-W12的体内抗肿瘤活性和安全性;采用免疫组化研究前药CPT-W12对肿瘤组织中Ki-67、Caspase-3、Bcl-2和MMP-2蛋白表达情况的影响,探讨其可能的抗肿瘤作用机制。研究结果:(1)成功设计并合成了 12种全新的水溶性肿瘤靶向喜树碱前药CPT-X和8种PSMA水解产物CPT-MX。(2)体外细胞毒活性和PSMA靶向性研究表明前药CPT-X对各种肿瘤细胞均表现出一定的增殖抑制活性,但活性显著低于原药CPT;大部分前药CPT-X对PSMA过表达的人前列腺癌细胞LNCaP-FGC的增殖抑制活性显著强于PSMA阴性表达的肿瘤细胞MCF-7、PC-3、DU145、HepG2和Hela,同时对人正常肝细胞LO2毒性较低,表现出较好的细胞毒选择性和PSMA靶向性;流式细胞分析和激光共聚焦荧光观察进一步验证了前药CPT-W12良好的细胞毒选择性和PSMA靶向性,其能显著诱导LNCaP-FGC(PSMA+)细胞凋亡,而对HepG2(PSMA-)凋亡诱导活性较弱;同时CPT-W12能够有效地在LNCaP-FGC(PSMA+)细胞内聚集,而在HepG2(PSMA-)聚集较少。(3)体内外稳定性、靶向性和初步药代动力学研究表明前药CPT-W12具有较好的PSMA敏感性和缓冲盐稳定性,其能被rh PSMA特异性水解;CPT-W12还具有良好的体内靶向性,其能有效地在肿瘤部位聚集和滞留;与喜树碱相比,其体内半衰期显著延长。(4)体内抗肿瘤活性评价表明前药CPT-W12对人乳腺癌细胞MCF-7裸鼠移植瘤具有明显的抑制作用;低剂量CPT-W12(110mg·kg-1)、中剂量CPT-W12(30mg·kg-1)和高剂量CPT-W12(60mg·kg-1)组肿瘤抑制率分别为51.67%、57.78%和65.00%,中剂量CPT-W12组抑瘤率和阳性药伊立替康组(10mg·kg-1)相当,高剂量CPT-W12组抑瘤率优于伊立替康组。血液生化和组织病理学研究发现前药CPT-W12能显著降低喜树碱的肾毒性,即使CPT-W12给药剂量达到伊立替康的6倍,仍未发现明显的系统毒性。(5)体内抗肿瘤机制研究表明前药CPT-W12可以有效降低Ki-67和Bcl-2蛋白表达水平,升高Caspase-3蛋白的表达水平,抑制肿瘤细胞增殖,促进肿瘤细胞凋亡;此外CPT-W12还能通过降低MMP-2的表达,抑制肿瘤的转移和肿瘤血管的新生。研究结论:本论文以PSMA作为靶点,在前药原理的指导下,成功设计并合成了12种肿瘤靶向的水溶性喜树碱前药CPT-X;前药CPT-X在体外表现出较强的细胞毒选择性、PSMA靶向性和稳定性;同时CPT-X在体内具有较强的抗肿瘤活性、肿瘤靶向性和安全性,其能有效地在肿瘤部位聚集并发挥抗肿瘤作用,其抗肿瘤活性与阳性药伊立替康相当,但是无明显的系统毒性;前药CPT-X成功克服喜树碱水溶性、稳定性及靶向性差的缺陷,同时显著延长了喜树碱的半衰期。本研究证明了基于PSMA的肿瘤靶向前药设计策略是有效、可行的,本研究有望为传统细胞毒药物的研发提供一个新思路,特别是中药中的一些难溶性的细胞毒药物;同时有望为临床乳腺癌等实体瘤的治疗提供一种新的分子靶向药物。
【图文】：

胞Ｂ１６Ｆ１０小鼠移植瘤模型显示该前药发挥了邋ＣＰＴ和Ａｒａ－Ｃ协同起效的作用，其抑瘤活逡逑性强于ＣＰＴ、Ａｒａ－Ｃ及ＣＰＴ／Ａｒａ－Ｃ。类似地，＾＾＾＾等［１９７］将喜树碱和抗肿瘤药物吉西逡逑他滨偶联构建了前药１１７邋（结构见图２０，该前药具有较强的水溶性、稳定性和还原敏逡逑感性，体外细胞活性显示其对Ｈｅｌａ和ＭＣＦ－７细胞的增殖抑制活性优于喜树碱和吉西他逡逑滨。此外，ＦｕｗｕＺｈａｎｇ等Ｉ１％将喜树碱与水溶性偶氮蓝染料衍生物连接合成了两亲性前逡逑药１１８邋（结构见图２１），体外实验显示该前药具有ＧＳＨ敏感性，体外细胞增殖抑制活性逡逑与ＣＰＴ相当；小鼠体内ＰＥＴ成像显示前药１１８在血液中滞留时间是喜树碱的１３０倍；逡逑且其对人结肠癌ＨＣＴ１１６移植瘤小鼠的抑瘤活性显著强于ＣＰＴ，同时毒性较小。逡逑Ｈ２Ｎ邋入Ｎ邋0逦ｎｏ逦0ＴＹＶＶ＾逡逑ｎｏ２逡逑。逡逑Ｊｈ。0＝？＝０逡逑＾°ｉ（＾Ｐ0Ａｎｈ＿０＿＾＾０逡逑１１１逦ＮＣ逡逑0ｒ逦ｐ（逡逑１１２逡逑１１３逦１１５逡逑图２０还原敏感型肿瘤靶向喜树碱衍生物１０９－１１４结构逡逑３０逡逑

图２４邋ＰＳＭＡ靶向成像试剂１２５－１３０的结构逡逑ＢａｎｄａｒｉＲＰ等［２８５］设计了胃泌素释放肽受体（ＧＲＰｒ）和人前列腺膜抗原（ＰＳ靶向的前列腺诊断探针邋１３１邋（［ＤＵＰＡ－６－Ａｈｘ－（６４Ｃｕ－ＮＯＤＡＧＡ）－５－Ａｖａ－ＢＢＮ（７－１４）Ｎ结构见图２５），，实验表明其能与ＬＮＣａＰ邋（ＰＳＭＡ＋）和ＰＣ－３邋（ＧＲＰｒ＋）细胞特异性结时ＭｉｃｒｏＰＥＴ闪烁扫描显示其在ＰＣ－３／ＬＮＣａＰ裸鼠移植瘤模型中能够有效地在肿聚集。逡逑Ｈ２Ｎ邋丫邋０逡逑ＣＯＯＨ逦０逦Ｈ邋０逦0邋Ｉ邋Ｈ邋0邋Ｉ邋Ｈ邋０逦Ｈ邋０逦９ｖ逡逑Ｈ。上人七逡逑：：，ｉｎｇＭ0，ｉｆ逦＼逦＾逦ＣＲＰＫ邋＾逦（逡逑ＨＮ、ｎ逦Ｗ／逦Ｈ逡逑°ｆ－？邋Ｘ逡逑ｐ－逡逑
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R284


本文编号：2676050