陈皮碱性提取物对肺纤维化小鼠的保护作用及对肺成纤维细胞凋亡的影响

发布时间：2020-05-22 14:03

【摘要】：目的:明确陈皮碱性提取物(CAE)对肺纤维化小鼠的干预作用,并探讨其对肺纤维化小鼠原代肺成纤维细胞凋亡的影响及作用机制。方法:1.将42只C57BL/6雄性小鼠随机分为正常组、模型组、CAE高剂量组(64mg/kg)、CAE中剂量组(32mg/kg)、CAE低剂量组(16mg/kg)、强的松组(6mg/kg)和吡菲尼酮组(100mg/kg)。除正常组外,其余各组小鼠均通过一次性气管内滴注博来霉素的方法建立肺纤维化模型,造模后第1天开始灌胃小鼠,正常组和模型组按100mg/kg生理盐水灌胃,其余各组按照相应的药物剂量灌胃,每天灌胃一次,连续灌胃28天后处死小鼠。记录小鼠体重变化;肺组织分别行HE染色、Masson染色,并计算肺泡炎和肺纤维化积分;ELISA法检测肺组织羟脯胺酸(HYP)、前列腺素E2(PGE2)、血清和肺泡灌洗液(BALF)中白细胞介素-17(IL-17)含量;免疫组化法测肺组织中胶原蛋白Ⅰ(collagenI)、胶原蛋白Ⅲ(collagenⅢ)、肺表面活性物质C前体(Pro-SPC)蛋白表达;免疫荧光法检测肺组织中Vimentin表达;TUNEL染色法检测肺组织凋亡。2.提取正常小鼠及模型小鼠的原代肺成纤维细胞,通过免疫组化方法检测Vimentin、α-SMA的表达;用四氮唑盐比色法(MTT法)检测CAE对肺成纤维细胞的抑制作用并计算其IC50;用乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒检测CAE对肺成纤维细胞的毒性;通过流式细胞仪及荧光染色方法检测CAE对肺成纤维细胞的凋亡作用;采用Western Blot方法检测Cleaved-Caspase3、Cleaved-PARP、Cleaved-Caspase8、Fas、Fas配体(FasL)、环氧化酶-2(COX-2)、前列腺素受体2(EP2)、磷酸化的p38(p-p38)等蛋白的表达;用氧化应激检测试剂盒检测CAE对肺成纤维细胞氧化应激的作用水平。结果:1.与正常组相比,模型组小鼠的肺泡炎和肺纤维化积分明显升高,而当给与不同剂量的CAE后肺泡炎和肺纤维化积分均有不同程度的降低(P0.05或P0.0.1)。2.与正常组相比,模型组小鼠肺组织中collagenⅠ、collagenⅢ、HYP的表达明显增加(P0.01),而当给与不同剂量的CAE后三者均有不同程度的降低(P0.05或P0.01)。提示CAE可抑制肺纤维化进程中的胶原沉积。3.与模型组相比,CAE中剂量组、CAE高剂量组小鼠肺组织中PGE2含量显著增加(P0.01);同时当给与CAE后可使肺纤维化小鼠血清和BALF中IL-17水平显著降低(P0.05 或 P0.01)。4.CAE干预后可使肺纤维化小鼠肺泡上皮细胞标记物Pro-SPC表达增加,肺成纤维细胞标记物Vimentin表达降低(P0.05或P0.01)。5.与正常组小鼠相比,模型组小鼠凋亡细胞数明显增加(P0.01);而与模型组比较,CAE高剂量组、CAE中剂量组、强的松组和吡菲尼酮组小鼠肺组织中的凋亡细胞数则显著性下降(P0.01)。6.模型小鼠的肺成纤维细胞表达Vimentin强度高于正常小鼠的肺成纤维细胞(P0.01)。同时,模型小鼠的肺成纤维细胞中α-SMA的阳性表达率和表达强度均高于正常小鼠的肺成纤维细胞(P0.01)。7.在两种肺成纤维细胞中加入不同浓度的CAE,MTT实验结果表明CAE对两种肺成纤维细胞增殖均有抑制作用(P0.05或P0.01),IC50结果显示CAE对模型小鼠的肺成纤维细胞有更好的作用。8.流式细胞仪检测结果表明,经过CAE干预后模型小鼠的肺成纤维细胞凋亡率明显增加,且表现出剂量依赖性,同时荧光染色证实这个结果(P0.01);Western Blot结果显示,给予CAE后,Cleaved-Caspase3、Cleaved-PARP、Cleaved-Caspase8、Fas、FasL表达明显升高(P0.05或P0.01);COX-2、EP2的表达随药物浓度的升高而逐渐增加(P0.05或P0.01)。提示CAE可能通过促进COX-2表达启动膜受体凋亡途径诱导肺成纤维细胞凋亡。9.氧化应激荧光检测结果显示:经CAE干预后,氧化应激水平显著升高(P0.05或P0.01),且Western Blot结果发现p-p38水平显著升高。提示CAE对COX-2的调控作用可能与氧化应激活促进P38磷酸化有关结论:1.CAE能缓解博莱霉素诱导的肺纤维化小鼠的肺纤维化进展,其作用可能与其抑制胶原分泌、抑制炎症反应、保护肺泡上皮细胞、抑制肺成纤维细胞增殖方面有关。2.模型小鼠的肺成纤维细胞较正常小鼠的肺成纤维细胞有更好的研究价值。CAE可有效诱导模型小鼠肺成纤维细胞的凋亡,其作用机制可能与氧化应激调控的p38/COX-2信号通路有关。
【图文】：

而毛发无明显异常；其余各组的小鼠精神状态、毛发和食量均正常。逡逑３．２小鼠体重变化逡逑如图２－１所示，除正常组小鼠体重一直在增加外，其余各组小鼠在造模后一周内体重都逡逑是下降的，造模一周后体重逐渐开始增长。终体重比较结果表明，模型组小鼠与正常组小逡逑鼠相比体重明显下降（户＜0．0１），各给药组与模型组相比体重有不同程度的升高，其中ＣＡＥ逡逑高剂量组、ＣＡＥ中剂量组及强的松组有统计学意义（Ｐ＜０．０１）（图２－２）。逡逑３５－１逡逑Ｎｏｒｍａｌ逡逑一逦ｈ？－邋ＢＬＭ逡逑Ｉ邋３0－逦Ｘ邋Ｍ逡逑Ｉ逦Ｔ逦—邋Ｌ逡逑■６＊邋２５－逦ＪＬ一＾一邋一＂Ｘ逦Ｉ邋－Ｏ－邋Ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ逡逑＾逦一逦Ｐｉｒｆｅｎｉｄｏｎｅ逡逑２０＋逦＾逦１逦？—逡逑０逦７逦１４逦２１逦２８逡逑Ｉ＇ｉ邋ｍｅ（邋ｃｌａｙｓ）逡逑图２－ｌ邋ＣＡＥ对小鼠体重变化影响逡逑注：ＮｏｒｍｏＬ？正常组，ＢＬＭ：模型组，Ｈ：邋ＣＡＥ高剂量组，Ｍ：邋ＣＡＥ中剂量组，Ｌ：邋ＣＡＥ低剂量组，Ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ：逡逑强的松组，Ｐｉｒｆｅｎｉｄｏｎｅ：卩比菲尼酮组。逡逑３５－ｉ逡逑ｃｘ逡逑＾逦＊＊逡逑５￡邋３０－下逡逑ｉ．ｙ．．．逡逑｜逦■逦基品邋丁邋＊逡逑合逦＾逦＾逦＾逡逑，＇逦，ｖ。逡逑图２－２邋ＣＡＥ对小鼠终体重影响逡逑注：Ｎｏｒｍｏｈ正常组，ＢＬＭ：模型组，Ｈ：邋ＣＡＥ高剂量组，Ｍ：邋ＣＡＥ中剂量组，Ｌ：邋ＣＡＥ低剂量组，逡逑Ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ：强的松组

而毛发无明显异常；其余各组的小鼠精神状态、毛发和食量均正常。逡逑３．２小鼠体重变化逡逑如图２－１所示，除正常组小鼠体重一直在增加外，其余各组小鼠在造模后一周内体重都逡逑是下降的，造模一周后体重逐渐开始增长。终体重比较结果表明，模型组小鼠与正常组小逡逑鼠相比体重明显下降（户＜0．0１），各给药组与模型组相比体重有不同程度的升高，其中ＣＡＥ逡逑高剂量组、ＣＡＥ中剂量组及强的松组有统计学意义（Ｐ＜０．０１）（图２－２）。逡逑３５－１逡逑Ｎｏｒｍａｌ逡逑一逦ｈ？－邋ＢＬＭ逡逑Ｉ邋３0－逦Ｘ邋Ｍ逡逑Ｉ逦Ｔ逦—邋Ｌ逡逑■６＊邋２５－逦ＪＬ一＾一邋一＂Ｘ逦Ｉ邋－Ｏ－邋Ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ逡逑＾逦一逦Ｐｉｒｆｅｎｉｄｏｎｅ逡逑２０＋逦＾逦１逦？—逡逑０逦７逦１４逦２１逦２８逡逑Ｉ＇ｉ邋ｍｅ（邋ｃｌａｙｓ）逡逑图２－ｌ邋ＣＡＥ对小鼠体重变化影响逡逑注：ＮｏｒｍｏＬ？正常组，ＢＬＭ：模型组，Ｈ：邋ＣＡＥ高剂量组，Ｍ：邋ＣＡＥ中剂量组，Ｌ：邋ＣＡＥ低剂量组，Ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ：逡逑强的松组，Ｐｉｒｆｅｎｉｄｏｎｅ：卩比菲尼酮组。逡逑３５－ｉ逡逑ｃｘ逡逑＾逦＊＊逡逑５￡邋３０－下逡逑ｉ．ｙ．．．逡逑｜逦■逦基品邋丁邋＊逡逑合逦＾逦＾逦＾逡逑，＇逦，ｖ。逡逑图２－２邋ＣＡＥ对小鼠终体重影响逡逑注：Ｎｏｒｍｏｈ正常组，ＢＬＭ：模型组，Ｈ：邋ＣＡＥ高剂量组，Ｍ：邋ＣＡＥ中剂量组，Ｌ：邋ＣＡＥ低剂量组，逡逑Ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ：强的松组
【学位授予单位】：南京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5

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本文编号：2676109