白花丹参中丹参酮类和酚酸类化合物抗血栓活性评价及机制研究

发布时间：2020-05-22 15:24

【摘要】：血栓性疾病,是一种由血栓形成和血栓栓塞两种病理过程引起的疾病,按照血栓形成部位分类主要分为静脉血栓、动脉血栓和毛细血管血栓三大类。血栓的形成可导致严重的心脑血管事件的发生,如卒中(CVA)、血栓闭塞性脉管炎(TAO)、动脉粥样硬化(AS)等。根据世界卫生组织的报道,全球十大致死性疾病统计数据显示,缺血性心脏病和CVA致死人数位于世界前列。丹参是唇形科植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)的干燥根及根茎,是中国传统中药。临床上,丹参制剂不但可以用于治疗心血管和脑血管疾病,也可以用于治疗慢性肾炎、慢性肾衰竭、2型糖尿病和传染性疾病等,应用广泛。白花丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge.f.alba C.Y.WuH.W.Li.)主要来源于山东莱芜、章丘和济南郊区等地,是丹参的变种,在当地一直代替传统中药丹参使用。有学者在二十世纪出就开始对丹参里面的有效成分进行研究。在此后的几十年里,研究者陆陆续续从白花丹参中发现了许多的化合物,并且通过成分分析发现丹参和白花丹参的主要化学成分基本相同。但白花丹参的植株中除了花以外,其他部位包括根、茎、叶的有效活性成分均高于丹参植株,因此白花丹参具有比较好的临床应用和研究价值。临床上,白花丹参常用来替代丹参用于对心脑血管类疾病治疗,包括AS、AMI、高脂血症和高血压等。本课题组对白花丹参中的丹参酮类和酚酸类成分进行抗血栓活性研究,旨在从抗血栓形成的角度,评价白花丹参中治疗心脑血管疾病的有效成分,为其临床应用提供理论依据,并为进一步开发和利用白花丹参资源奠定基础。本课题选取从白花丹参中提取分离得到的12种丹参酮类化合物和12种酚酸类化合物,并以TNF-α诱导的EA.hy926内皮细胞为模型,评价了这些化合物的抗血栓活性,并研究了其中脱氧基新隐丹参酮(7)和紫草酸(J)可能的作用机制。本实验采用MTT法检测丹参酮类化合物的细胞毒,CCK-8法检测酚酸类化合物作用下EA.hy926的细胞活力;使用酶联免疫吸附法(ELISA)研究了丹参酮类和酚酸类化合物对TNF-α诱导的EA.hy926细胞上清液中PAI-1和t-PA表达水平的影响;采用实时荧光定量逆转录聚合链式反应法(qRT-PCR)检测化合物对TNF-α诱导的EA.hy926细胞的PAI-1和t-PA的mRNA表达水平的影响;生色底物法检测化合物在EA.hy926细胞的表达和体外抗FXa和FIIa活性;蛋白质免疫印迹(Western blot)法检测化合物脱氧基新隐丹参酮和紫草酸对TNF-α诱导的EA.hy926 细胞 p65、p-p65、p38、p-p38、JNK 和 p-JNK 的蛋白表达水平影响。实验结果显示,12种丹参酮类化合物中,多数化合物能够抑制PAI-1蛋白水平和基因水平的表达,其中脱氧基新隐丹参酮能够浓度依赖性地抑制PAI-1蛋白水平和基因水平的表达;而丹参酮类化合物显示出了对t-PA的蛋白和基因水平的表达的促进作用;同时生色底物实验结果显示脱氧基新隐丹参酮具有和丹参酮IIA相当的抗FXa和抗FIIa活性;机制研究发现,两者活性化合物的抗血栓机制不同,脱氧基新隐丹参酮能明显地抑制p-p65和pJNK的蛋白水平表达,但是对p-p38蛋白的表达无显著作用,其抗血栓机制是通过NF-κB/JNK通路实现的。在12种酚酸类化合物的研究中发现,紫草酸具有较强的抑制PAI-1蛋白水平和基因水平的表达作用,其抗FXa和FIIa活性较丹酚酸B强;同时发现紫草酸能够同时阻滞p-p65、pJNK和p-p38的表达,其抗栓机制是通过抑制NF-κB/JNK/p38 MAPK信号通路实现的。综上所述,本论文通过对白花丹参提取物中的主要成分和部分微量成分包括12种丹参酮类化合物和12种酚酸类化合物进行抗血栓活性评价,筛选出了脱氧基新隐丹参酮和紫草酸两种抗血栓活性较好的化合物,为进一步的抗血栓药物研究提供了基础的理论依据,也为其治疗血栓性心脑血管疾病的临床研究提供了参考。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285

【参考文献】